32001D0183[1]

A Bizottság határozata (2001. február 22.) az egyes halbetegségek kimutatására és megállapítására szolgáló mintavételi tervek és diagnosztikai módszerek meghatározásáról és a 92/532/EGK határozat hatályon kívül helyezéséről (az értesítés a C(2001) 426. számú dokumentummal történt)

A Bizottság határozata

(2001. február 22.)

az egyes halbetegségek kimutatására és megállapítására szolgáló mintavételi tervek és diagnosztikai módszerek meghatározásáról és a 92/532/EGK határozat hatályon kívül helyezéséről

(az értesítés a C(2001) 426. számú dokumentummal történt)

(EGT vonatkozású szöveg)

(2001/183/EK)

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a 98/45/EK irányelvvel [1] módosított, a tenyésztett víziállatok és az akvakultúra-termékek forgalomba hozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről szóló, 1991. január 28-i 91/67/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 15. cikkére,

mivel:

(1) Az egyes halbetegségek kimutatására és megállapítására szolgáló mintavételi terveket és diagnosztikai módszereket a 96/240/EK bizottsági határozattal [3] módosított 92/532/EGK bizottsági határozat [4] állapította meg.

(2) A 92/532/EGK határozat elfogadása óta új gyakorlati és tudományos eredmények születtek, és a 91/67/EGK irányelvet módosították. Emiatt a mintavételi tervek és a diagnosztikai módszerek naprakész állapotba hozatala vált szükségessé.

(3) E naprakész állapotba hozatal a pisztrángok vírusos vérfertőzése (VHS, vírusos haemorrhagiás septicaemia) és a fertőző vérképzőszervi elhalás (IHN, infectiosus haemopoieticus necrosis) vírusának vizsgálatára és azonosítására, valamint a 91/67/EGK határozattal összhangban történt legutóbbi módosítások megfelelő változásaira vonatkozik.

(4) A 93/53/EGK tanácsi irányelvvel [5] létrehozott halbetegségek közösségi referencialaboratóriumával egyeztetés történt.

(5) Az egyes halbetegségek kimutatására és megállapítására szolgáló, a 92/532/EGK határozat által meghatározott mintavételi terveket és diagnosztikai módszereket az érthetőség érdekében hatályon kívül kell helyezni.

(6) Az e határozatban előírt intézkedések összhangban vannak az Állat-egészségügyi Állandó Bizottság véleményével,

ELFOGADTA EZT A HATÁROZATOT:

1. cikk

A vírusos vérzéses vérfertőzés (VHS) és a fertőző vérképzőszervi elhalás (IHN) kimutatására és megállapítására szolgáló mintavételi terveket és diagnosztikai módszereket a melléklet határozza meg.

2. cikk

Ez a határozat hatályon kívül helyezi a 92/532/EGK határozatot.

3. cikk

Ennek a határozatnak a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 2001. február 22-én.

a Bizottság részéről

David Byrne

a Bizottság tagja

[1] HL L 46., 1991.2.19., 1. o.

[2] HL L 189., 1998.7.3., 12. o.

[3] HL L 337., 1992.11.21., 18. o.

[4] HL L 79., 1996.3.29., 19. o.

[5] HL L 175., 1993.7.19., 23. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

A PISZTRÁNGOK VÍRUSOS VÉRFERTŐZÉSE (VHS) ÉS A FERTŐZŐ VÉRKÉPZŐSZERVI ELHALÁS (IHN) KIMUTATÁSÁRA ÉS MEGÁLLAPÍTÁSÁRA SZOLGÁLÓ MINTAVÉTELI TERVEK ÉS DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK

BEVEZETÉS

E melléklet:

a) előírja a vírusos vérzéses vérfertőzés (VHS) és a fertőző vérképzőszervi elhalás (IHN) előfordulásának kimutatására és megállapítására szolgáló mintavételi tervek és diagnosztikai módszerek irányelveit és minimális követelményeit;

b) egységes rendszerbe foglalja a 91/67/EGK irányelv B. és C. mellékletének az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok minősítésének megadására és fenntartására vonatkozó rendelkezéseit;

c) felsorolja - a 91/67/EGK irányelv 5. és 6. cikkével összhangban - a VHS és az IHN megfelelő diagnosztizálására és az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok minősítésének hivatalos elismerésére irányuló rendelkezéseket;

d) vonatkozik mind a VHS és az IHN elleni védekezésért felelős hatóságokra, mind az e betegségekre irányuló vizsgálatokat végző laboratóriumi személyzetre. Ennek megfelelően a hangsúly a mintavételi eljáráson, a laboratóriumi vizsgálatok alapelvein és alkalmazásán, az eredmények értékelésén, valamint a részletes laboratóriumi módszereken van. Az adott esetnek megfelelően a laboratóriumok azonban módosíthatják az ebben a mellékletben leírt vizsgálatokat vagy használhatnak más vizsgálatokat, feltéve hogy azonos érzékenység és specifikusság mutatható ki.

Az I. rész tartalmazza a VHS és az IHN előfordulásának ellenőrzésére szolgáló mintavételi terveket és diagnosztikai módszereket, amelyek az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok mentes minősítésének elnyerését és megtartását szolgálják.

A II. rész leírja a VHS és az IHN megállapítására szolgáló diagnosztikai eljárásokat fertőzés gyanúja esetén.

A III. rész felsorolja a hatósági egészségügyi vizsgálati program kritériumait és irányelveit, amelyek dokumentálják a VHS-től, illetve az IHN-től való előzményi mentességet.

A IV. rész ajánlásokat tartalmaz a VHS és az IHN vírustitrálás folyamatára, amelynek célja a sejttenyészetek fertőzés iránti fogékonyságának ellenőrzése.

A mozaikszavakat és a rövidítéseket az V. részben sorolják fel.

I. RÉSZ A VHS és az IHN előfordulásának ellenőrzésére szolgáló mintavételi tervek és diagnosztikai módszerek az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok mentes minősítésének elnyerése és megtartása céljából

I. Vizsgálatok és mintavétel

1. Általános rendelkezések, amelyek az övezetek vagy a nem mentes övezetekben levő gazdaságok VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítésének elnyerése és fenntartása érdekében végzett ellenőrzést szolgáló klinikai egészségügyi vizsgálatokra, mintavételekre és a minták kiválasztására vonatkoznak

Az övezetekben vagy a nem mentes övezetekben levő gazdaságokban, azok VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítésének elnyerése és fenntartása céljából a 91/67/EGK irányelv B. és C. mellékletének megfelelően végzendő klinikai egészségügyi vizsgálatokat és a halszövetből, illetve petefészek-folyadékból végzendő mintavételezést az 1A., 1B. és 1C. táblázat foglalja össze. További részletek az I. I. 2.-I. I. 4. részben kerülnek megállapításra. Az 1A. és 1B. táblázat nem alkalmazható új gazdaságok, valamint olyan gazdaságok esetén, ahol mentes övezetből vagy nem mentes övezetben levő mentes gazdaságból származó hallal, ikrával vagy ivarsejttel kezdik újra a munkát, feltéve hogy eleget tesznek a 91/67/EGK irányelv C. mellékletének I. A. 6. a) vagy I. A. 6. b), illetve II. A. 3. a) vagy II. A. 3. b) alpontjában megállapított követelményeknek.

A klinikai vizsgálatokat az októbertől júniusig tartó vagy valamely olyan időszakban kell elvégezni, amikor a vízhőmérséklet 14 °C alatt van. Ha a gazdaságokat évente kétszer kell klinikai vizsgálat alá vetni, a vizsgálatok között legalább négy hónapnak kell eltelnie. Minden termelési egységet (tavak, tartályok, hálós ketrecek stb.) meg kell vizsgálni elhullott, legyengült vagy abnormális viselkedésű halak jelenlétének megállapítása céljából. Különös figyelmet kell fordítani a vízkifolyás környékére, ahol a vízáramlás miatt a legyengült halak hajlamosak összegyűlni.

A mintavételezés alá eső halakat a következők szerint kell kiválogatni:

- ha szivárványos pisztráng is előfordul, akkor csak e faj egyedeit kell kiválogatni a mintavételhez. Ha szivárványos pisztráng nem fordul elő, akkor az összes többi előforduló halfajból kell mintát venni, amennyiben ezek a fajok fogékonyak a VHSV-re, illetve az IHNV-re (amint azt a 91/67/EGK irányelv A. melléklete sorolja fel). A fajoknak arányosan kell szerepelniük a mintában,

- ha egynél több vízforrást használnak haltermelésre, minden vízforrás esetében mintát kell venni az ott található halakból,

- ha gyenge, abnormális viselkedésű vagy frissen elhullott (bomlásnak még nem indult) halak is előfordulnak, akkor elsősorban azokat kell kiválasztani. Ha ilyen egyedek nem találhatók, a kiválasztott halak között normális külsejű, egészséges halaknak is lenniük kell, amelyeket úgy kell begyűjteni, hogy azok a mintában arányosan képviseljék a gazdaság minden részét és valamennyi korosztályt.

2. Speciális rendelkezések, amelyek az övezetek vagy a nem mentes övezetekben levő gazdaságok VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítésének elnyerése és fenntartása érdekében végzett ellenőrzésekre vonatkoznak, beleértve a minták gyűjtését

1. Egy, a hatósági szolgálat felügyelete alá helyezett övezet vagy egy nem mentes övezetben levő gazdaság az alábbi feltételek valamelyike esetén nyerheti el a VHS-re, illetve az IHN-re vonatkozó mentes minősítést:

a) "A" modell - kétéves felügyeleti terv

A VHS, illetve az IHN bármely klinikai vagy egyéb tünetének jelentkezése nélkül eltelt legalább kétéves időszakot követően az adott övezetben levő minden gazdaságot vagy egy nem mentes övezetben levő minden mentesítendő gazdaságot egészségügyi vizsgálatnak kell alávetni évente kétszer, két éven át. E kétéves ellenőrzési időszak során, amely megelőzi a mentes minősítés elnyerését, továbbra sem szabad előfordulnia a VHS, illetve az IHN semmilyen klinikai vagy egyéb tünetének, és vizsgálat céljából mintákat kell venni az 1A. táblázatnak megfelelően. Ezt követően a mintákat az I. I.-I. IV. részben leírtak alapján kell kiválogatni, előkészíteni és megvizsgálni, és a laboratóriumi vizsgálatoknak VHS-re, illetve IHN-re negatív eredményt kell adniuk; vagy

b) "B" modell - kétéves felügyeleti program csökkentett mintamérettel

A hatósági egészségügyi vizsgálati programot követően, amely legalább négy évre visszamenőleg igazolja, hogy nem lépett fel VHS, illetve IHN, az övezetben levő minden gazdaságot vagy egy nem mentes övezetben levő minden mentesítendő gazdaságot egészségügyi vizsgálatnak kell alávetni évente kétszer, két éven át. E kétéves ellenőrzési időszak során, amely megelőzi a mentes minősítés elnyerését, továbbra sem szabad előfordulnia a VHS, illetve az IHN semmilyen klinikai vagy egyéb tünetének, és vizsgálat céljából mintákat kell venni az 1B. táblázatnak megfelelően. Ezt követően a mintákat az I. I.-I. IV. részben leírtak alapján kell kiválogatni, előkészíteni és vizsgálni, és a laboratóriumi vizsgálatoknak VHS-re, illetve IHN-re nézve negatív eredményt kell adniuk. Ahhoz, hogy az egészségügyi vizsgálati program a hivatalos szervek részéről elismerhető legyen a VHS-től, illetve az IHN-től való mentesség igazolása céljából, a programnak meg kell felelnie a III. részben felsorolt kritériumoknak és irányelveknek.

2. Különleges rendelkezések új gazdaságok és olyan gazdaságok mentesítésére vonatkozóan, amelyek mentes övezetből vagy nem mentes övezetben levő mentes gazdaságból származó hallal, ikrával vagy ivarsejttel kezdik újra a munkát

Az új gazdaságok és az olyan gazdaságok, amelyekben mentes övezetből vagy nem mentes övezetben levő mentes gazdaságból származó hallal, ikrával vagy ivarsejttel kezdik újra a munkát, a 91/67/EGK irányelv C. mellékletének I. A. 6. a/b) vagy II. A. 3. a/b) alpontjában megállapított követelményeknek megfelelően nyerhetik el a minősítést. Ennek megfelelően a fenti A. és B. mintában (I. I. 2. 1. a) és I. I. 2. I. b) pont) megállapított mintavételi rendelkezések nem alkalmazhatók ilyen gazdaságok esetében.

3. A VHS-re, illetve az IHN-re vonatkozó engedélyezett minősítés fenntartása céljából folytatott felügyeleti program

Egy övezet vagy egy nem mentes övezetben levő gazdaság VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítésének fenntartása érdekében a vizsgálatokat és a vizsgálathoz szükséges mintavételezéseket az 1C. táblázatnak megfelelően kell elvégezni. A mintákat az I. I.-I. IV. részben leírtak alapján kell kiválogatni, előkészíteni és vizsgálni, és a laboratóriumi vizsgálatoknak VHS-re, illetve IHN-re negatív eredményt kell adniuk.

3. A halból származó minták előkészítése és szállítása

Szállítás vagy a laboratóriumba történő küldés előtt a vizsgálandó szervek darabjait steril bonceszközökkel kell eltávolítani a halból, és azokat szállító tápfolyadékot, azaz 10 % borjúsavót és antibiotikumot is magában foglaló sejttenyésztő tápfolyadékot tartalmazó steril műanyag csövekbe kell helyezni. Milliliterenként (ml) 200 nemzetközi egység (NE) penicillin, 200 μg streptomycin és 200 μg kanamycin kombinációja javasolható, de más, bizonyítottan hatékony antibiotikum is használható. A vizsgálandó szövet a lép, a fejvese, ezenkívül a szív vagy az agyvelő. Néhány esetben vizsgálni kell a petefészek-folyadékot is (1A.-C. táblázat).

A maximum 10 halból (1A.-C. táblázatok) származó petefészek-folyadékot vagy szervdarabokat lehet egy steril csőbe is gyűjteni, amely legalább 4 ml szállító tápfolyadékot tartalmaz, és ez alkot egy közös mintát (elegymintát). Az egyes szövetmintáknak minimum 0,5 gramm (g) tömegűnek kell lenniük.

A csöveket szigetelt tartályokba (például vastag falú polisztirol dobozokba) kell helyezni és elegendő jéggel vagy jégakkuval kell ellátni a laboratóriumba szállítás alatt a minták hűtésének biztosítása érdekében. A fagyasztást el kell kerülni. A szállítás alatt a minták hőmérséklete nem haladhatja meg a 10 °C-ot, és átvételkor a szállítódobozban jégnek kell lennie, vagy egy vagy több jégakkunak még mindig részben vagy egészen fagyottnak kell lennie.

A virológiai vizsgálatot minél hamarabb el kell kezdeni, legkésőbb a minták gyűjtését követő 48 órán belül. Kivételes esetekben [1] a virológiai vizsgálat legkésőbb az anyag gyűjtését követő 72 órán belül is elkezdhető, feltéve hogy a vizsgálati anyag a szállító tápfolyadékkal védett volt és a szállítás alatti hőmérsékleti követelmények teljesíthetők (I. rész I. 3. 3. pont).

Egész halak is küldhetők a laboratóriumba, ha a szállítás alatti hőmérsékleti követelmények teljesíthetők. Az egész hal nedvszívó papírba is csomagolható, és azt végül a fentiek szerint hűtött műanyag zsákban kell szállítani. Élő hal is szállítható.

Minden csomagolást és címkézést - az adott esetnek megfelelően - az aktuális nemzeti és nemzetközi szállítási szabályokkal összhangban kell elvégezni.

4. Kiegészítő diagnosztikai anyagok gyűjtése

A közreműködő diagnosztikai laboratóriummal kötött megállapodásnak megfelelően kiegészítő vizsgálatokra más halszövet is gyűjthető és előkészíthető.

II. A minták előkészítése virológiai vizsgálatra

1. Fagyasztás kivételes esetekben

Ha gyakorlati nehézségek adódnak (pl. rossz időjárási viszonyok, munkaszüneti napok, zavarok a laboratórium működésében stb.), amelyek lehetetlenné teszik a sejtek beoltását a szövetminták gyűjtését követő 48 órán belül, elfogadható az is, ha a szövetmintákat lefagyasztják sejttenyésztő tápfolyadékban -20 °C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten, és a virológiai vizsgálatokat 14 napon belül elvégzik. A szövet azonban csak egy esetben fagyasztható le és olvasztható fel a vizsgálatot megelőzően. Részletes feljegyzéseket kell vezetni minden esetben arról, hogy mi indokolta a szövetminták lefagyasztását (például vihar, sejtvonalak elpusztulása stb.).

2. A szervek homogenizálása

A laboratóriumban a csövekben levő szövetet teljesen homogenizálni kell (emésztéssel, elegyítővel vagy steril homokkal teli dörzscsészében kézi (mozsár)törővel), és azután az eredeti szállító tápfolyadékban kell feloldani azt.

Ha a minta 4 cm-nél kisebb hosszúságú egész halakból áll, akkor ezeket a végbélnyílás mögötti rész eltávolítása után steril ollóval vagy szikével össze kell darabolni. Ha a minta 4 és 6 cm közötti testhosszúságú egész halakból áll, akkor a belső szerveket kell összegyűjteni, a vesét is beleértve. Ha a minta 6 cm-nél hosszabb egész halakat tartalmaz, akkor a szövetmintákat az I. rész I. 3. pontjában leírtak alapján kell gyűjteni. A szövetmintákat steril ollóval vagy szikével össze kell darabolni, a fent leírtak alapján homogenizálni kell, és a szállító tápfolyadékban fel kell oldani.

A szövetminta és a szállító tápfolyadék közötti végső arányt a laboratóriumban kell beállítani 1:10 értékre.

3. A homogenizátum centrifugálása

A homogenizátumot hűtött centrifugában, 2 °C és 5 °C között, 2000-től 4000 × g fordulaton, 15 percen át centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük és 15 °C-on négy órán át vagy 4 °C-on egész éjszakán át antibiotikummal kezeljük, pl. gentamicinnel, amelyből 1 mg/ml-es koncentráció hasznos lehet ebben a lépésben.

Ha a minta szállítása szállító tápfolyadékban (azaz antibiotikum-kezeléssel) történt, a felülúszó antibiotikumos kezelése elhagyható.

Az antibiotikumos kezelés célja a minta bakteriális szennyeződésének meggátlása, ami szükségtelenné teszi a membránszűrőn keresztül történő szűrést.

Ha az összegyűjtött felülúszót -80 °C-on tároljuk, akkor az a mintavételt követő 48 órán belül egyszer újra felhasználható virológiai vizsgálatokhoz.

Ha gyakorlati nehézségek adódnak (pl. meghibásodik az inkubátor, problémák merülnek fel a sejttenyésztéssel stb.), amelyek lehetetlenné teszik a sejtek beoltását a szövetminták gyűjtését követő 48 órán belül, az is elfogadható, ha a felülúszót -80 °C-ra lefagyasztják, és a virológiai vizsgálatot 14 napon belül elvégzik.

A sejtek beoltása előtt a felülúszót összekeverjük az IPN vírus helyben előforduló szerotípusaival szembeni, megfelelően hígított, a felülúszóval azonos mennyiségű antisavóval és ezzel inkubáljuk legalább 1 órán keresztül 15 °C-on vagy legfeljebb 18 órán át 4 °C-on. Az antisavó titerének legalább 1/2000-nek kell lennie az 50 %-os plakkneutralizációs tesztben.

Az inokulumoknak az IPN vírussal (amely vírus Európa egyes területein a halminták 50 %-ában előfordul) szembeni antisavóval történő kezelése azt a célt szolgálja, hogy megakadályozható legyen az IPN vírus okozta CPE kialakulása a beoltott sejttenyészetekben. Ez csökkenti a virológiai vizsgálatok időtartamát, valamint azon esetek számát, amelyekben a CPE előfordulását a VHSV vagy az IHNV lehetséges jelzőjének kellene tekinteni.

Ha a minták olyan termelési egységekből származnak, amelyeket IPN-től mentesnek tekintenek, az inokulum IPN vírus elleni antisavóval való kezelése elhagyható.

III. Virológiai vizsgálat

1. Sejttenyészetek és tápfolyadékok

A BF-2 vagy az RTG-2 és az EPC vagy az FHM sejteket 20 %-os benőttségig szaporítjuk 30 °C-on a megfelelő tápfolyadékban, pl. Eagle's MEM-ben (vagy ennek módosított változatában), amelyet 10 %-os magzati borjúsavóval és állandó koncentrációjú antibiotikumokkal egészítettek ki.

Ha a sejteket zárt üvegekben tenyésztjük, ajánlott a tápfolyadékot bikarbonáttal pufferolni. A nyitott egységekben levő sejttenyésztő tápfolyadékok Tris-HCl-lel (23 mM) és Na-bikarbonáttal (6 mM) pufferolhatók. A pH-értéknek 7,6 ± 0,2-nek kell lennie.

A szövetmintával való beoltásra használt sejttenyészeteknek frissnek (4-48 órásnak) kell lenniük, és sejtjeiknek a beoltás során aktívan kell szaporodniuk (nem összenőtt sejttenyészet).

2. A sejttenyészetek beoltása

Az antibiotikummal kezelt szervszuszpenziót két hígításban - az elsődleges hígításban és azon kívül annak 1:10 hígításaként - oltjuk be a sejttenyészetekbe, a szövetminta 1:100, illetve 1:1000 arányú végső hígítását eredményezve a sejttenyésztő tápfolyadékban (a homológ kölcsönhatás elkerülése érdekében). Legalább két sejtvonalat kell beoltani (lásd az I. III. 1. pontot). A beoltott anyag és a sejttenyésztő tápfolyadék mennyisége közötti aránynak 1:10 körül kell lennie.

Minden hígításhoz és minden sejtvonalhoz egy legalább 2 cm2-es területet kell használni, amely megfelel a 24 vájatú szövettenyésztő lemez egy vájatának. Szövettenyésztő lemezek használata ajánlott, de más hasonló vagy nagyobb növekedési területű egységek is elfogadhatók.

3. A sejttenyészetek inkubálása

A beoltott sejttenyészeteket 15 °C-on 7-től 10 napig inkubáljuk. Ha a sejttenyésztő tápfolyadék színe pirosról sárgára változik, az a tápfolyadék savasodását jelzi, a pH-t steril bikarbonát oldattal vagy ennek megfelelő anyaggal be kell állítani a sejtek vírusfertőzés iránti fogékonyságának biztosítása érdekében.

Legalább hathavonként - vagy amennyiben a sejtek fogékonyságának csökkenése gyanítható - el kell végezni a fagyasztott VHSV és IHNV törzsek titrálását a sejttenyészetek fertőzés iránti fogékonyságának ellenőrzése céljából. Az ajánlott eljárás a IV. részben kerül meghatározásra.

4. Mikroszkópos vizsgálat

A beoltott sejttenyészeteket a CPE előfordulásának megállapítása céljából rendszeresen vizsgálni kell (legalább hetente háromszor) 40-150-szeres nagyításban. Nyilvánvaló CPE észlelése esetén a vírusazonosítási eljárást az I. IV. pontnak megfelelően azonnal meg kell kezdeni.

5. Másodlagos tenyészet

Ha az elsődleges, 7-10 napos keltetést követően CPE nem alakul ki, akkor másodlagos tenyészetet kell friss sejttenyészetekkel létrehozni, amelynek során az elsődleges sejttenyészetekhez hasonló területet kell használni.

Az elsődleges tenyészetet képező összes tenyészetből/tenyésztőlemez-vájatból származó tápfolyadék (felülúszó) egyenlő részeit 7-10 napos beoltást követően a sejtvonalaknak megfelelően összegyűjtjük. Az összegyűjtött anyagot azután beoltjuk a hígítatlan és az I. rész III. 2. pontjában leírtak alapján 1:10 arányban hígított homológ sejttenyészetekbe (amely a felülúszó 1:10, illetve 1:100 arányú végső hígítását eredményezi). Másrészt az elsődleges tenyészetet képező 10 %-os tápfolyadék egyenlő mennyiségeit közvetlenül beoltjuk a friss sejttenyészetet tartalmazó tenyésztőlemez-vájatba (átoltás lemezről lemezre). A beoltást megelőzheti a hígított anyag előzetes keltetése az IPN vírussal szembeni, az I. II. 3. pontban leírtak alapján megfelelően hígított antisavóval.

A beoltott tenyészeteket azután 7-10 napig inkubáljuk 15 °C-on az I. III. 4. pontban leírt megfigyelés mellett.

Ha toxikus CPE fordul elő az inkubálás első három napjában, akkor már ebben a stádiumban létrehozható a másodlagos tenyészet, de azután a sejteket hét napon át inkubálni kell, majd újra létre kell hozni a másodlagos tenyészetet, amelyet aztán ismét hét napig kell inkubálni. Ha a toxikus CPE már három nap után kialakul, a sejtek egyszer passzálhatók és inkubálhatók az elsődleges beoltástól számított 14 napos teljes inkubációs idő eléréséig. Az inkubáció utolsó hét napján nem mutatkozhat toxicitásra utaló jel.

Ha az antibiotikumos kezelés ellenére bakteriális fertőződés fordul elő, akkor az átoltást megelőzően 2000-4000 × g fordulaton történő centrifugálást kell végezni 15-30 percig 2-5 °C-on és/vagy a felülúszót 0,45 μm-es szűrőn (alacsony fehérjekötő-képességű membránon) kell átszűrni. Ezenkívül a másodlagos tenyészet létrehozása hasonló a toxikus CPE esetéhez.

IV. Vírusazonosítás

1. Vírusazonosítási tesztek

Ha a sejttenyészetben CPE észlelhető, a tápfolyadékot (felülúszót) összegyűjtjük és a következő egy vagy több módszerrel vizsgáljuk: neutralizáció, IF, ELISA. Ha e próbák nem teszik lehetővé a vírus pontos azonosítását egy héten belül, akkor a felülúszót továbbítani kell azonnali azonosítás céljából a nemzeti referencialaboratóriumba vagy az EU halbetegségekkel foglalkozó referencialaboratóriumába.

2. Neutralizáció

A sejteket az összegyűjtött felülúszóból centrifugálással (2000-4000 × g) vagy alacsony fehérjekötő-képességű membránon (0,45 μm) keresztüli szűréssel távolítjuk el, és a felülúszót 1:100 és 1:10000 arányban hígítjuk a sejttenyésztő tápfolyadékban.

A kétféle felülúszó-hígítás egyenlő részeit a következő reagensek azonos mennyiségeivel összekeverjük és azokat 60 percig 15 °C-on külön-külön inkubáljuk:

- VHSV elleni csoportspecifikus ellenanyagot tartalmazó savó 1:50 (V/V) hígításban [2],

- IHNV elleni csoportspecifikus ellenanyagot tartalmazó savó 1:50 (V/V) hígításban [3],

- az IPNV adott helyen előforduló szerotípusai ellen termelt antisavók elegye 1:50 (V/V) hígításban [4],

- a tápfolyadék önmagában (pozitív kontroll).

Minden vírusfelülúszó-savó keverékből 50 μl-t legalább két sejttenyészetbe beoltunk és a tenyészeteket azután 15 °C-on inkubáljuk. A CPE kialakulását az I. III. 4. pontban leírtak alapján ellenőrizzük.

Néhány VHSV törzs nem reagál a neutralizációs próbára. Az ilyen izolátumokat IF-fel vagy ELISA-módszerrel kell azonosítani.

Más, bizonyítottan hatásos neutralizációs próbák is használhatók.

3. IF

Minden vírusizolátum azonosításához legalább nyolc fedőlemezre vagy ezzel egyenértékű lemezre oltjuk rá a sejteket olyan sűrűségben, amely 24 órás tenyésztés után 60-90 %-os benőttséghez vezet. Erre a célra az EPC sejtek ajánlottak az üvegfelülethez való erős tapadásuk miatt, de más sejtvonalak, mint pl. a BF-2, az RTG-2 vagy az FHM is használhatók.

Amikor a sejtek leülepedtek az üvegfelületre (körülbelül a ráoltás után egy órával), vagy ha a tenyészetet maximum 24 órán keresztül inkubálták, beoltjuk a meghatározandó vírust. Négy tenyészetet oltunk be 1:10 térfogatarányban és négy tenyészetet 1:1000 arányban. Ezeket 15 °C-on 20-30 órán keresztül inkubáljuk.

Inkubálás után a tenyészeteket kétszer átmossuk Eagle's MEM-ben, 80 %-os jéghideg acetonnal fixáljuk, majd kétrétegű IFAT segítségével megfestjük. Az első reagensréteg referenciaminőségű poliklonális vagy monoklonális ellenanyagokat tartalmaz. A második réteg egy fluorokróm vegyülettel konjugált antisavó, amely az első réteg immunglobulinjához kapcsolódik. Minden vizsgált antisavóhoz legalább egy nagy dózissal és egy kis dózissal beoltott tenyészetet kell megfesteni. A vizsgálatban megfelelő negatív és pozitív kontrollokat kell alkalmazni. Az ajánlott fluorokróm vegyületek az FITC vagy a TRITC.

A festett tenyészeteket glicerines sóoldat segítségével a tárgylemezre helyezzük. Beeső ultraibolya (UV) fényben vizsgáljuk. Ehhez 10-szeres, illetve 12-szeres okulárt és 25-szörös vagy 40-szeres objektívet használunk, > 0,7-es, illetve > 1,3-as numerikus rekeszértékkel.

A fent említett IF módszer példaként szolgál. Más, bizonyítottan hatékony IF módszerek (a sejttenyészeteknek, a fixálásnak és a referenciaminőségű ellenanyagoknak megfelelően) is használhatók.

4. ELISA

A mikrotitráló lemez vájatait a vizsgálatot megelőző éjszakán befedjük a referenciaanyag tisztított immunoglobulin-frakcióinak ajánlott hígításaival.

A vájatok PBS-Tween-20 pufferrel való mosása után a meghatározandó vírust kétszeres-négyszeres hígítási sorban adjuk a vájatokhoz és hagyjuk reakcióba lépni a bevonatot képező ellenanyaggal 60 percen át 37 °C-on. A PBS-Tween-20 pufferes mosást követően hozzáadjuk a bevonatot képező ellenanyagoknak megfelelő biotinnal jelölt specifikus ellenanyagot és 60 percen át hagyjuk reagálni 20 °C-on. Egy további, a fentiek szerinti mosás után HRP-vel konjugált streptavidint adunk hozzá és hagyjuk reagálni egy órán át 20 °C-on. Az utolsó mosás után a megfelelő ELISA-szubsztrátumok (OPD vagy más) segítségével a megkötött enzim láthatóvá tehető.

A fent említett biotin-avidin alapú ELISA próba példaként szolgál. Más, bizonyítottan hatékony ELISA próbák is használhatók helyette.

1A. TÁBLÁZAT

Vizsgálati és mintavételi terv az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok kétéves ellenőrzési időszakára vonatkozóan, amely megelőzi a VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítés elnyerését

(a 91/67/EGK irányelv B. és C. mellékletének és e melléklet I. részében felsorolt rendelkezéseknek megfelelően)

Az elegymintába összegyűjtött halak maximális száma: 10

[5] [6] [7] [8]

| Klinikai vizsgálatok száma évenként (két év) | Laboratóriumi vizsgálatok száma évenként (két év) | [5]Laboratóriumi vizsgálatok a vírus jelenlétének kimutatására |

Növendékhalak száma (szervminta) | Tenyésztett halak száma (petefészek-folyadék) |

Szárazföldi övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 2 | 120 (első vizsgálat) [6] 150 (második vizsgálat) | 30 (első vizsgálat) [7] 0 (második vizsgálat) |

b)Gazdaságok csak keltetett állománnyal | 2 | 1 | 0 | 150 (első vagy második vizsgálat) [7] |

c)Gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 150 (első és második vizsgálat) | 0 |

Part menti övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 2 | 120 (első vizsgálat) 150 (második vizsgálat) | 30 (első vizsgálat) [7] 0 (második vizsgálat) |

b)Lazacféléket tenyésztő gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 30 (első és második vizsgálat) [8] | 0 |

c)Nem lazacféléket tenyésztő gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 150 (első és második vizsgálat) | 0 |

1B. TÁBLÁZAT

A kétéves ellenőrzési időszakra vonatkozó vizsgálati és mintavételi terv az olyan övezetekben és az olyan nem mentes övezetekben levő gazdaságokban történő VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítés elnyerését megelőzően, amelyekben az e betegségektől való mentesség hivatalosan elismert és igazolt

(a 91/67/EGK irányelv B. és C. mellékletének és e melléklet I. és III. részében felsorolt rendelkezéseknek megfelelően)

Az elegymintába összegyűjtött halak maximális száma: 10

[9] [10] [11]

| Klinikai vizsgálatok száma évenként (két év) | Laboratóriumi vizsgálatok száma évenként (két év) | Laboratóriumi vizsgálatok a vírus jelenlétének kimutatására |

Növendékhalak száma (szervminta) | Tenyésztett halak száma (petefészek-folyadék) |

Szárazföldi övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 2 | 0 (első vizsgálat) [5] 30 (második vizsgálat) | 30 (első vizsgálat) [6] 0 (második vizsgálat) |

b)Gazdaságok csak keltetett állománnyal | 2 | 1 | 0 | 30 (első vagy második vizsgálat) [6] |

c)Gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 30 (első és második vizsgálat) | 0 |

Part menti övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 2 | 0 (első vizsgálat) 30 (második vizsgálat) | 30 (első vizsgálat) [6] 0 (második vizsgálat) |

b)Lazacféléket tenyésztő gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 30 (első és második vizsgálat) [7] | 0 |

c)Nem lazacféléket tenyésztő gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 2 | 30 (első és második vizsgálat) | 0 |

1C. TÁBLÁZAT

Vizsgálati és mintavételi terv az övezetek és a nem mentes övezetekben levő gazdaságok VHS-re, illetve IHN-re vonatkozó mentes minősítésének fenntartása érdekében

(a 91/67/EGK irányelv B. és C. mellékletének és e melléklet I. részében felsorolt rendelkezéseknek megfelelően)

Az elegymintába összegyűjtött halak maximális száma: 10

[12] [13] [14]

| Klinikai vizsgálatok száma évenként (két év) | [5]Laboratóriumi vizsgálatok a vírus jelenlétének kimutatására |

Növendékhalak száma (szervminta) | Tenyésztett halak száma (petefészek-folyadék) |

Szárazföldi övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 20 (első vagy második vizsgálat) | 10 (első vagy második vizsgálat) [6] |

b)Gazdaságok csak keltetett állománnyal | 2 | 0 | 30 (első vagy második vizsgálat) [6] |

c)Gazdaságok keltetett állomány nélkül | 2 | 30 | 0 |

Part menti övezetek és gazdaságok

a)Gazdaságok keltetett állománnyal | 2 | 20 (első vagy második vizsgálat) | 10 (első vagy második vizsgálat) [6] |

b)Gazdaságok keltetett állomány nélkül | 1 | 30 [7] | 0 |

II. RÉSZ Járványkitörés gyanúja esetén alkalmazandó, a VHS és az IHN megállapítására szolgáló diagnosztikai eljárás

A VHS és az IHN diagnosztizálására a következő egy vagy több módszert kell alkalmazni:

- hagyományos vírusizolálás azt követő indirekt víruskimutatással,

- vírusizolálás egyidejűleg végzett indirekt víruskimutatás mellett,

- más diagnosztikai módszerek (IFAT, ELISA).

A VHS, illetve IHN engedélyezett övezetben levő gazdaságokban előforduló első esetének megállapítása nem történhet kizárólag a C. módszer alapján. Az A. vagy a B. módszert is alkalmazni kell.

A virológiai vizsgálatra szánt szövetmintát néhány esetben - differenciáldiagnózis felállítása céljából - bakteriológiai, parazitológiai, szövettani vagy egyéb vizsgálatokra szánt kiegészítő anyagnak kell kísérnie.

A. Hagyományos vírusizolálás azt követő szerológiai víruskimutatással

I.1. A minták kiválasztása

Legalább 10, az IHN vagy a VHS tipikus tüneteit mutató halat kell a vizsgálatra kiválasztani.

I.2. A halból származó minták előkészítése és szállítása

Az I. rész I. 3. pontjában megállapítottak szerint.

I.3. Kiegészítő diagnosztikai anyagok gyűjtése

Az I. rész I. 4. pontjában megállapítottak szerint.

II. A minták előkészítése virológiai vizsgálatra

Az I. rész II. pontjában megállapítottak szerint.

III. Virológiai vizsgálatok

Az I. rész III. pontjában megállapítottak szerint.

IV. Víruskimutatás

Az I. rész IV. pontjában megállapítottak szerint.

B. Vírusizolálás egyidejűleg végzett szerológiai víruskimutatás mellett

I.1. A minták kiválasztása

A II. rész A. I. 1. pontjában megállapítottak szerint.

I.2. A halból származó minták előkészítése és szállítása

Az I. rész I. 3. pontjában megállapítottak szerint.

I.3. Kiegészítő diagnosztikai anyagok gyűjtése

Az I. rész I. 4. pontjában megállapítottak szerint.

II.1. A szervek homogenizálása

Az I. rész II. 2. pontjában megállapítottak szerint.

II.2. A homogenizátum centrifugálása

A homogenizátumot hűtött centrifugában 2-5 °C-on centrifugáljuk 2000-4000 × g fordulaton 15 percig, a felülúszót összegyűjtjük és 15 °C-on négy órán át kezeljük antibiotikummal, pl. 1 mg/ml gentamicinnel, vagy átszűrjük alacsony fehérjekötő-képességű membránon (0,45 μm).

II.3. A felülúszó kezelése diagnosztikai antisavókkal

Az antibiotikummal kezelt vagy membránon át szűrt szervszuszpenziót 1:10 és 1:1000 arányban hígítjuk a sejttenyésztő tápfolyadékkal és ennek egyenlő mennyiségeit összekeverjük és 60 percen át 15 °C-on keltetjük az I. IV. 2. pontban felsorolt, azonos mennyiségű reagensekkel.

III.1. Sejttenyészetek és tápfolyadékok

Az I. rész III. 1. pontjában megállapítottak szerint.

III.2. A sejttenyészetek beoltása

Valamennyi - a II. rész B. II. 3. pontjában megállapítottak szerint készített - vírus-savó keverékből 50 μl-t beoltunk sejtvonalanként legalább két sejttenyészetbe.

III.3. A sejttenyészetek keltetése

Az I. rész III. I. pontjában megállapítottak szerint.

III.4. Mikroszkópos vizsgálat

A beoltott sejttenyészeteket a CPE előfordulásának megállapítása céljából naponta vizsgálni kell 40-150-szeres nagyításban. Ha az alkalmazott antisavók egyike meggátolja a CPE kialakulását, akkor ennek megfelelően a víruskimutatás elvégzettnek tekinthető.

Ha a CPE kialakulását egyik antisavó sem gátolja, akkor az I. IV. résznek megfelelő víruskimutatási eljárást kell alkalmazni.

III.5. Másodlagos tenyészet létrehozása

Ha 7-10 nap után nem fordul elő CPE, akkor egy másodlagos tenyészetet kell létrehozni a felülúszóval és tápfolyadékkal (II. B. II. 3. pont) beoltott tenyészetekből az I. III. 5. pontnak megfelelően.

C. Más diagnosztikai módszerek

Az I. rész II. 2. pontjában leírtak alapján előkészített felülúszó alávethető IFAT vagy ELISA vizsgálatoknak az I. IV. 3., illetve az I. IV. 4. pontnak megfelelően. E gyors módszereket ki kell egészíteni az A. vagy B. fejezetnek megfelelő virológiai vizsgálatokkal a mintavételt követő 48 órán belül:

a) negatív eredmény esetén; vagy

b) pozitív eredmény esetén, ha az anyag a VHS vagy IHN mentes övezetben előforduló első esetét jelenti.

A szövetminta alávethető más diagnosztikai módszereknek is, mint az RT-PCR, IF fagyasztott metszeteken és a formalinban fixált szövetmintán végzett immunhisztokémiai vizsgálat. E módszereket a sejttenyészetek fixálatlan szövetmintával való beoltásának kell mindig kísérnie.

III. RÉSZ A VHS-től, illetve az IHN-től való igazolt korábbi mentesség az övezetekben vagy a nem mentes övezetekben levő gazdaságokban

A hatósági egészségügyi vizsgálati programra vonatkozó irányelvek és kritériumok

1. Az egészségügyi vizsgálati program csak akkor indítható:

- ha befejeződött a hivatalosan elismert VHSV, illetve IHNV mentesítési program, beleértve a gazdaságban levő összes hal eltávolítását, a tisztítást, a fertőtlenítést és a terület pihentetését az engedélyezett gazdaságokból származó halakkal való újratelepítés előtt, vagy

- azokban a halkeltető állomásokon, ahol korábban nem fordult elő VHSV vagy IHNV fertőzés.

2. Az egészségügyi vizsgálati programnak klinikai és laboratóriumi vizsgálatokon kell alapulnia.

3. A programban évi két klinikai egészségügyi vizsgálatnak kell szerepelnie az I. részben megadott irányelvekkel összhangban.

4. Minden évben legalább egy vizsgálatot kell elvégezni, amelynek során 30 halszövetből, illetve petefészek-folyadékból származó mintát kell gyűjteni minden gazdaság esetén. A mintákat az I., a II. és a IV. résznek megfelelően kell kiválogatni, előkészíteni és laboratóriumi vizsgálat alá vetni.

5. Az egészségügyi vizsgálati programot legalább négy éven keresztül kell folytatni az összes, övezetben levő gazdaságban vagy - nem mentes övezetben levő - mentesítendő gazdaságban.

6. A program hivatalos elismeréséhez az szükséges, hogy VHS vagy IHN megbetegedés ne forduljon elő, vagy ilyen fertőzés ne legyen kimutatható (klinikai tünetekben megnyilvánuló fertőzés vagy vírusizolálás).

IV. RÉSZ A sejttenyészetek fertőzés iránti fogékonyságának ellenőrzésére irányuló titrálási eljárás

Az I. III. 3. pontban említett titrálási eljárás az alábbiakból áll:

Legalább két VHSV és egy IHNV izolátumot kell használni. Az izolátumoknak az EU-n belül előforduló vírusok fő csoportját kell képviselniük, pl. a VHSV esetén egy édesvízi, a szivárványos pisztrángból származó kórokozó izolátum, egy tengeri, a nagy rombuszhalat megbetegítő izolátum és az IHNV esetén egy, a szivárványos pisztrángot megbetegítő európai törzs izolátuma. A tagállamokból származó, pontosan meghatározott izolátumokat kell használni. Referenciaizolátumokat az EU halbetegségekkel foglalkozó referencialaboratóriuma bocsát rendelkezésre.

A kevés számú átoltással nyert vírussarzsokat sejttenyésztő palackban levő BF-2 vagy RTG-2 sejteken szaporítjuk a VHSV esetén, és EPC vagy FHM sejteken az IHNV esetén. Legalább 10 % savót tartalmazó sejttenyésztő tápfolyadékot kell használni. A beoltáshoz alacsony MOI érték használandó (< 1).

Teljes CPE esetén a vírust a sejttenyészet felülúszójának 2000 × g fordulaton, 15 percig való centrifugálásával lefejtjük, 0,45 μm-es membránszűrőn átszűrjük és kiadagoljuk megjelölt fagyasztócsövekbe. A vírust -80 °C-on tároljuk.

A fagyasztás után egy héttel minden vírusból három párhuzamos ampullát felolvasztunk hideg vízben, és a megfelelő sejtvonalon titráljuk. Legalább hathavonként, vagy ha a sejtvonal fogékonyságának csökkenésére vonatkozóan gyanú áll fenn, minden vírusizolátumot felolvasztunk és titrálunk.

A titrálási eljárást részletesen le kell írni és mindig ugyanazon eljárást kell követni.

A véghígításos titrálás során legalább hat párhuzamost kell alkalmazni minden hígítási lépésnél. A titereket össze kell hasonlítani a korábban kapott titerekkel. Ha a három vírusizolátum bármelyikének titere egy vagy több log2 értékkel csökken az eredeti titerhez képest, akkor a sejtvonal nem használható többet felügyeleti célokra.

Ha a laboratóriumban különböző sejtvonalakat tartanak, akkor minden vonalat külön-külön vizsgálni kell.

A feljegyzéseket legalább 10 évig meg kell őrizni.

V. RÉSZ Mozaikszavak és rövidítések

BF-2 Naphalivadék -2 (sejtvonal)

CPE Citopatogén hatás

CRL A halbetegségek közösségi referencialaboratóriuma

ELISA ELISA (szilárd fázisú enzim-immunpróba)

EPC Epithelioma papulosum cyprini (sejtvonal)

FHM Fürge cselle (sejtvonal)

FITC Fluoreszcein-izotiocianát

Hepes N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etán-szulfonsav

HRP Torma-peroxidáz

IF Immunfluoreszcencia

IFAT Indirekt immunfluoreszcenciás vizsgálat

IHN(V) Fertőző vérképzőszervi elhalás (vírusa)

IPN Fertőző hasnyálmirigy-elhalás (vírusa)

MEM Minimum eszenciális tápfolyadék

MOI A fertőzés multiplicitása (a tenyészethez hozzáadott fertőző vírusrészecskék száma és a tenyészetben levő ismert számú sejtek közötti arány)

OPD Ortofenilén-diamin

PBS Foszfátpuffer-oldat

RTG-2 Szivárványos pisztráng ivarszerv (sejtvonal)

RT-PCR Reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció

Tris-HCl Tris (hidroximetil) aminometán - HCl

TRITC Tetrametil-rodamin-izotiocianát

VHS(V) Pisztrángok vírusos vérfertőzése (vírusa)

[1] Kivételes esetekben, pl. ha a halakat nagyon távoli területeken gyűjtötték, ahol nincs lehetőség a naponkénti feladásra.

[2] Illetve, ahogy az ellenőrző laboratórium az antisavók lehetséges citotoxicitásának megfelelően meghatározta.

[3] Illetve, ahogy az ellenőrző laboratórium az antisavók lehetséges citotoxicitásának megfelelően meghatározta.

[4] Illetve, ahogy az ellenőrző laboratórium az antisavók lehetséges citotoxicitásának megfelelően meghatározta.

[5] Alternatív módon az 1B. táblázatban felsoroltak alapján csökkentett mintaszám alkalmazható, ha a II. 1., I. I. 2.1. b) és III. részben leírt követelmények teljesülnek.

[6] Klinikai vizsgálatok.

[7] Kivételes körülmények között, ha petefészek-folyadék kinyerése nem lehetséges, akkor szervek gyűjthetők helyette.

[8] A mintákat a halak édesvízből sós vízbe való áthelyezését követő legalább három hét eltelte után kell gyűjteni.

[9] Klinikai vizsgálatok.

[10] Kivételes körülmények között, ha petefészek-folyadék kinyerése nem lehetséges, akkor szervek gyűjthetők helyette.

[11] A mintákat a halak édesvízből sós vízbe való áthelyezését követő legalább három hét eltelte után kell gyűjteni.

[12] Mentes övezetekben csak a halgazdaságok 50 %-ában kell mintákat gyűjteni, azok évenkénti változtatásával. A nem mentes övezetekben levő mentes gazdaságokban minden évben kell mintát gyűjteni.

[13] Kivételes körülmények között, ha petefészek-folyadék kinyerése nem lehetséges, akkor szervek gyűjthetők helyette.

[14] A mintákat a halak édesvízből sós vízbe való áthelyezését követő legalább három hét eltelte után kell gyűjteni.

--------------------------------------------------