31992L0095[1]

A Bizottság 92/95/EGK irányelve (1992. november 9.) a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról szóló 76/732/EGK hetedik bizottsági irányelv mellékletének módosításáról

A Bizottság 92/95/EGK irányelve

(1992. november 9.)

a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról szóló 76/732/EGK hetedik bizottsági irányelv mellékletének módosításáról

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a legutóbb a Spanyolország és Portugália csatlakozási okmányával módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i 70/373/EGK tanácsi irányelvre [1] és különösen annak 2. cikkére,

mivel a 81/680/EGK irányelvvel [2] módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról szóló, 1976. március 1-jei 76/732/EGK hetedik bizottsági irányelv [3] előírja az aflatoxin B1 kimutatására használatos módszereket;

mivel indokolt e módszerek kiigazítása a tudományos és műszaki ismeretek előrehaladására tekintettel, mivel tanácsos különösen olyan módszer rendelkezésre bocsátása, amely alkalmas a legutóbb a 91/132/EGK irányelvvel [4] módosított, a takarmányban előforduló nemkívánatos anyagok és termékek megengedett legmagasabb szintjének meghatározásáról szóló, 1973. december 17-i 74/63/EGK tanácsi irányelvben [5] rögzített rendkívül alacsony aflatoxinszintek ellenőrzésére;

mivel ajánlatos olyan módszereket is tartani, amellyel az aflatoxin B1 meghatározható interferáló anyagokban, például citrusgyümölcsökből készült pép esetében;

mivel az ebben az irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével,

ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:

1. cikk

A 76/372/EGK irányelv melléklete e határozat mellékletével összhangban módosul.

2. cikk

A tagállamok legkésőbb 1993. október 1. előtt hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

Amikor a tagállamok elfogadják ezen intézkedéseket, azokban hivatkozni kell ezen irányelvre vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.

3. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

Kelt Brüsszelben, 1992. november 9-én.

a Bizottság részéről

Ray Mac Sharry

a Bizottság tagja

[1] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.

[2] HL L 246., 1981.8.29., 32. o.

[3] HL L 102., 1976.4.15., 8. o.

[4] HL L 66., 1991.3.13., 16. o.

[5] HL L 38., 1974. 2.11., 31. o.

--------------------------------------------------

MELLÉKLET

I. Az A. "Egydimenziós vékonyréteg-kromatográfiás módszer" részben az 1. pontban a "Cél és alkalmazási terület" szöveg helyébe az alábbi szöveg lép:

"1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé tesz az aflatoxin B1 szintjének meghatározását a nyersanyagokban és egynemű takarmányokban. Ezt a módszert nem lehet alkalmazni citrusgyümölcsökből készült pép jelenlétében. A meghatározás alsó méréshatára 0,01 mg/kg (10 ppb).

Ha a meghatározást interferáló anyagok jelenléte hátráltatja, akkor a B. módszer (nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia) alkalmazásával meg kell ismételni az analízist."

II. A B. "Kétdimenziós vékonyréteg-kromatográfiás módszer" részben a szöveg helyébe az alábbi szöveg lép:

"B. AFLETOXIN B1 MEGHATÁROZÁSA. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZER

1. Cél és alkalmazási terület

A jelen módszer alkalmas aflatoxin B1 meghatározására takarmányokban, beleértve a citrusgyümölcsökből készült pépet tartalmazó takarmányt is. A kimutatás alsó határa 0,001 mg/kg.

2. A módszer elve

A mintát kloroformmal extraháljuk. A kivonatot leszűrjük, és egy meghatározott részét először Florisil, majd C18 SPE oszlopon tisztítjuk. Az elválasztás és a meghatározás nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC), fordított fázisú C18 oszlopon történik, vízben oldott jóddal végzett elválasztás utáni származékképzés és fluoreszcens detektálás alkalmazásával.

Megjegyzés:

A mikotoxinok erősen mérgező anyagok. A műveleteket e célra kijelölt elszívófülkében kell végezni. Különleges óvintézkedésekre van szükség, amikor a toxinok száraz állapotban vannak, és ebből következően hajlamosak a munkaterületen való szétszóródásra.

3. Reagensek

3.1. Kloroform, 0,5-1 tömeg % etanollal stabilizálva (Lásd a "Megjegyzések" 10.2. szakaszát.)

3.2. Metanol, HPLC tisztaságú, a 3.6. szerinti mobil fázis elkészítéséhez

3.3. Aceton

3.4. Acetonitril, HPLC tisztaságú

3.5. Oldószerelegyek: felhasználás előtt egy nappal készítendő, vagy az oldószerből a levegőt ultrahangos rázatással kell eltávolítani.

3.5.1. Aceton és víz 98:2 arányú elegye

3.5.2. Víz és metanol 80:20 arányú elegye

3.5.3. Víz és aceton 85:15 arányú elegye

3.6. Eluens oldat HPLC-hez

Víz, metanol és acetonitril 130:70:40 arányú elegye.

Megjegyzés:

A rendelkezésre álló HPLC oszlop tulajdonságaitól függően szükségessé válhat a mobil fázis összetételének változtatása.

3.7. Telített jódoldat: Adjunk 2 g jódot 400 ml vízhez. Keverjük legalább 90 percig, majd szűrjük le membránszűrőn (4.15.) keresztül. A fény okozta bomlás elkerülése végett az oldatot fénytől védve tartjuk.

3.8. Savval mosott Celite 545 vagy azzal egyenértékű adszorbens.

3.9. Florisil SPE oszlop (Waters-SEP-PAK vagy azzal egyenértékű).

3.10. C18 SPE oszlop (Waters-SEP-PAK vagy azzal egyenértékű).

3.11. Inert gáz, pl. nitrogén.

3.12. Aflatoxin B1 standardoldat, 10 μg/ml koncentrációjú. Az oldat koncentrációját az alábbiak szerint ellenőrizzük: Vegyük fel az oldat spektrumát 330 és 370 nm között spektrofotométerrel (4.23.). Mérjük az abszorbanciát (A) a maximumhelyen, 363 nm-en. Az aflatoxin B1-oldat koncentrációját az alábbi képlet segítségével számítjuk ki és mikrogramm/ml-ben kapjuk meg:

Concentration (μg/ml) =

= 13,991 × A

3.12.1. Aflatoxin B1 kloroformos standard törzsoldat

Az aflatoxin B1 standardoldat (3.12.) 2,5 ml-ét kvantitatíve vigyük át egy 50 ml-es mérőlombikba és kloroformmal (3.1.) állítsuk jelre az oldat térfogatát. Ezt az oldatot hűvös (4 °C), sötét helyen, jól lezárva és alufóliába csomagolva tároljuk.

3.13. Aflatoxin B1 HPLC kalibrálóoldatok

Megjegyzés:

Az oldatok készítéséhez savval mosott üvegárut (lásd 4. Eszközök) használjunk.

3.13.1. 4 ng/ml-es kalibrálóoldat

A mérőlombikban lévő standard törzsoldatot (3.12.1.) alumíniumfóliába csomagolva állni hagyjuk addig, míg szobahőmérsékletűre melegszik (néhány órát). A törzsoldat 400 μl-ét (200 ng aflatoxin B1-et) 50 ml-es mérőlombikba visszük át, és inertgáz- (3.11.) áramban szárazra pároljuk.

Az így nyert maradékot kb. 20 ml víz/aceton elegyben (3.5.3.) oldjuk, víz/aceton eleggyel jelig töltjük a lombikot, és jól összerázzuk.

3.13.2. 3 ng/ml-es kalibrálóoldat

A kalibráló oldat (3.13.1.) 7,5 ml-ét kvantitatíve 10 ml-es mérőlombikba visszük át, jelig töltjük a víz/aceton eleggyel (3.5.3.), és jól összerázzuk.

3.13.3. 2 ng/ml-es kalibrálóoldat

A kalibrálóoldat (3.13.1.) 25 ml-ét kvantitatíve 50 ml-es mérőlombikba visszük át, jelig töltjük a víz/aceton eleggyel (3.5.3.), és jól összekeverjük.

Ez az oldat lesz az összehasonlító (referencia-) standard is, amelyet a HPLC vizsgálat során ismételten kell a rendszerbe injektálni.

3.13.4. 1 ng/ml-es stabilizálóoldat

A kalibrálóoldat (3.13.1.) 2,5 ml-ét kvantitatíve 10 ml-es mérőlombikba visszük át, jelig töltjük a víz/aceton eleggyel (3.5.3.), és jól összerázzuk.

3.14. 1 ml kloroformban oldott, 1 μg aflatoxin B1-et, 0,5 μg aflatoxin B2-t, 1 μg aflatoxin G1-et, és 0,5 μg aflatoxin G2-t tartalmazó ampulla.

3.14.1. Kromatográfiás tesztoldat

Az ampulla (3.14.) tartalmát vigyük át üvegdugós kémcsőbe vagy csavaros tetővel ellátott fiolába. Az oldat 40 μl-ét vigyük savval mosott üvegdugós kémcsőbe (4.21.). Inertgázáramban párologtassuk el a kloroformot, és a maradékot oldjuk újra 10 ml víz/aceton elegyben (3.5.3.).

3.15. A megerősítő teszt vegyszerei

3.15.1. Nátrium-klorid, telített oldat

3.15.2. Nátrium-szulfát, vízmentes, granulált

4. Eszközök

Figyelmeztetés: Vizes aflatoxinoldatok esetében a savval át nem mosott üvegedényzet veszteséget okozhat. Különös gonddal kell ügyelni az új és az egyszer használatos üvegárukra, mint az automata injektor mintatartó fiolái és Pasteur-pipetták. Ezért az aflatoxin vizes oldatával kapcsolatba kerülő laboratóriumi üvegedényzetet néhány órára híg savba (pl. 2 mol/l koncentrációjú kénsavba) kell áztatni, majd desztillált vízzel alaposan kiöblíteni a savnyomok eltávolítására (legalább háromszor öblítsünk, és az öblítővizet pH-papírral ellenőrizzük). Ezt a műveletet el kell végezni a vákuumbepárlóhoz használt gömblombikkal (4.4.), a mérőlombikokkal, mérőedényekkel, a kalibrálóoldatok és mérésre előkészített oldatok tárolására használt kémcsövekkel és fiolákkal is.

4.1. Őrlő-homogenizáló berendezés.

4.2. 1,0 mm lyukbőségű szita (ISO R565).

4.3. Mechanikai rázógép.

4.4. Rotációs vákuumlepárló, 150-250 ml-es gömblombikkal felszerelve.

4.5. HPLC készülék.

4.6. HPLC analitikai oszlop, 3 μm vagy 5 μm C18 töltettel.

4.7. Pulzálásmentes szivattyú a post-column jódreagens szállítására.

4.8. Zéró holttérfogatú Valco T idom, rozsdamentes acélból (1/16' × 0,75 mm).

4.9. Spirális reaktor; teflon vagy rozsdamentes acél. Az 5 μm vagy 3 μm töltetméretű HPLC oszlopokhoz a 3000 mm × 0,5 mm és 5000 × 0,5 mm közötti méretek bizonyultak a legcélszerűbbnek.

4.10. 60 °C-ra beállított, 0,1 °C-os pontossággal szabályozható termosztát.

4.11. Fluoreszcens detektor, gerjesztési hullámhossz 365 nm, emissziós hullámhossz 435 nm (szűrős készülékeknél emissziós hullámhossz > 400 nm). Alkalmas legyen legalább 0,05 ng aflatoxin B1 kimutatására.

4.12. Rekorder.

4.13. Integrátor (nem feltétlenül szükséges).

4.14. Redős szűrőpapír, átmérő: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 vagy azzal egyenértékű.

4.15. Membránszűrő, 0,45 μm pórusméretű, Millipore HAWP 04700 vagy azzal egyenértékű.

4.16. 500 ml-es üvegdugós Erlenmeyer-lombik.

4.17. Üvegoszlop (belső átmérő körülbelül 1 cm, hosszúság körülbelül 30cm, Luer véggel éllátva.

4.18. Luer(R) kloroformmal szemben ellenálló csap (pl. Bio-Rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T.Baker 4514 vagy ezekkel egyenértékű).

4.19. Vegyszereknek ellenálló fecskendő, 10 ml-es, Luer csatlakozó résszel.

4.20. 250 μl-es, HPLC injektáláshoz alkalmas fecskendő (lásd 4.5.).

4.21. 100 μl-es mikrofecskendő a kalibrálóoldatok készítéséhez.

4.22. 10 ml-es üvegdugós kalibrált kémcsövek.

4.23. Spektrofotométer, amely alkalmas a spektrum UV tartományában mérések elvégzésére.

4.24. A megerősítő vizsgálathoz (6) szükséges felszerelés.

4.23.1. Savval öblített 100 ml-es rázótölcsér tefloncsappal.

4.23.2. Fűtőblokk, 40-50 °C közti hőmérséklettel.

5. Vizsgálat

5.1. A minta előkészítése

Daráljuk meg a jól homogenizált mintát úgy, hogy áthulljon az 1 mm lyukbőségű szitán (4.2.), majd újból homogenizáljuk.

5.2. Bemérés

Az előkészített vizsgálati mintából 50 g-ot az Erlenmeyer-lombikba mérünk.

5.3. Extrakció

Adjunk 25 g Celitet (3.8.), 250 ml kloroformot (3.1.) és 25 ml vizet a bemért vizsgálati mintához az Erlenmeyer-lombikba.Dugaszoljuk be a lombikot, rázassuk a rázógépen (4.3.) 30 percig. Szűrjük át redős szűrőpapíron (4.14.). Gyűjtsünk össze 50 ml szűrletet. Ha szükséges, hígítsuk a szűrletet kloroformmal úgy, hogy az aflatoxin B1 koncentrációja a 4 ng/ml-t ne haladja meg.

5.4. Tisztítás (Az eljárást jelentősebb megszakítás nélkül kell elvégezni.)

Figyelmeztetés:

- Azt a laboratóriumot, ahol a vizsgálatot végzik, megfelelően védeni kell a természetes fénytől. Ennek megfelelő eszközei az alábbiak:

i. UV fényt elnyelő fólia az ablakokon, azzal kombinálva, hogy az ablakot direkt napfény nem éri;

ii. függönyök vagy redőnyök és mesterséges fény (fluoreszcens csövek megfelelőek).

- Az aflatoxint tartalmazó oldatokat a lehető legjobban védeni kell a fénytől (sötét helyen tartjuk, alufóliába burkoljuk).

5.4.1. Tisztítás Florisil SEP-PAK oszlopon

5.4.1.1. Az oszlopkészlet előkészítése

Tegyünk a Florisil-készlet rövidebb végére (3.9.) zárósapkát (4.18.) (lásd az 1. ábrát). Mossuk a készletet és távolítsuk el a segédletet 10 ml kloroformmal (3.1.) és egy fecskendő (4.19.) használatával fecskendezzünk át gyorsan 8 ml-t a zárósapkán. Csatlakoztassuk a készlet hosszabb szárát az üvegoszlophoz (4.17.), és a maradék 2 ml kloroformot fecskendezzük be az oszlopba a készleten keresztül. Zárjuk a zárósapkát. Húzzuk ki a fecskendőt.

5.4.1.2. Tisztítás

Adjuk az 5.3. szerint gyűjtött szűrletet az összeállított oszlopkészletbe és öntsük el. Öblítsük 5 ml kloroformmal (3.1.), majd 20 ml metil-alkohollal (3.2.). Öntsük el az eluátumot. E műveletek alatt biztosítsuk, hogy az oszlopkészlet-szerelék nem szárad ki.

Ezután mossuk az aflatoxin B1-et 40 ml aceton/víz keverékkel (3.5.1.), és gyűjtsük össze az eluátum teljes mennyiségét a rotációs bepárló gömblombikjába (4.4.). Koncentráljuk az eluátumot a rotációs bepárlón 40-50 °C között, amíg több aceton már nem desztillálódik. (Megjegyzés: Ekkorra körülbelül 0,5 ml folyadék marad a lombikban. Kísérletek kimutatták, hogy a további párologtatás nem káros, és amikor 0,5 ml folyadék marad, abban már nincs jelentős mennyiségű aceton. Az acetonmaradék az aflatoxin B1 elvesztéséhez vezethet a C18 készletben.) Adjunk hozzá 1 ml metil-alkoholt (3.2.), keverjük fel, hogy az aflatoxin B1 a lombik oldalán feloldódjon, adjunk hozzá 4 ml vizet és keverjük össze. Válasszuk le a készletet és dobjuk el. Öblítsük vízzel az üvegoszlopot és tartsuk vissza a C18 tisztítási lépéshez.

5.4.2. Tisztítás C18-as SPE oszlopon

5.4.2.1. Az oszlopkészlet összeállításának előkészítése.

Csatlakoztassunk egy zárósapkát (4.18.) a C18-készlet rövidebb végére (3,10) (lásd az 1. ábrát). Töltsük fel a készletet és távolítsunk el minden levegőt a zárósapkán 10 ml metil-alkohol gyors átfecskendezésével (4.19.). A készletben az egyébként szürke háttér előtt a légbuborékok világos pettyekként láthatók. Vegyünk 10 ml vizet és 8 ml-t nyomjunk át a készleten. (Kerüljük a levegő készletbe történő bejutását, amikor a metil-alkoholról vízre váltunk.) Csatlakoztassuk a készlet hosszabb szárát az üvegoszlophoz (4.17.), és a maradék 2 ml vizet fecskendezzük be az oszlopba a készleten keresztül. Zárjuk a zárósapkát. Húzzuk ki a fecskendőt.

5.4.2.2. Tisztítás

Vigyük fel az 5.4.1.2. pontban nyert kivonat teljes mennyiségét az üvegoszlopba (4.17.), öblítsük a lombikot kétszer 5 ml víz/metil-alkohol keverékkel (3.5.2.) és folyassuk el. E műveletek alatt biztosítsuk, hogy az oszlopkészlet-szerelék nem szárad ki. Ha légbuborékok fejlődnek a szűkületben a készlet mellett, állítsuk meg a folyamatot, és csapoljuk meg az üvegoszlop tetejét a légbuborékok eltávolítására. Majd folytassuk. Mossuk 25 ml víz/metil-alkohol keverékkel. Öntsük el az eluátumot. Ezután mossuk az aflatoxin B1-et 50 ml víz/aceton keverékkel (3.5.3.), és gyűjtsük össze az eluátum teljes mennyiségét egy 50 ml-es gömblombikba (4.4.). Öntsük fel a jelzésig vízzel és keverjük össze. A kapott vizsgálati oldatot használjuk a kromatográfiához (5.5.).

Figyelem:

Rendesen nem szükséges a végső kivonat szűrése a HPLC előtt. Ha szükségesnek tartott, ne használjunk cellulózszűrőt, mert az aflatoxin B1 eltűnését okozhatják. A teflonszűrők elfogadhatók.

5.5. Nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás mérés

(Lásd a 2. ábrát a felszerelés összeállításához) Biztosítsunk elegendő időt a műszerek kondicionálására és stabilizálására.

1. megjegyzés

A mobil fázis és a származékképző reagens áramlási sebességének értékei csak tájékoztató jellegűek. Ezeket a paramétereket az analitikai oszlop jellemzőitől függően szükség szerint változtatni lehet.

2. megjegyzés

Az aflatoxin B1 detektorjelének nagysága függ a hőmérséklettől, ezért annak folyamatos változását figyelembe kell venni (lásd a 3. ábrát). Azonos mennyiségű, aflatoxin B1 referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) rendszeres időközönként történő injektálásával (pl. minden harmadik injektálás) a referencia kalibrálóoldatok között injektált aflatoxin B1 csúcs alatti területeit korrigálhatjuk, ha az átlagos értéket vesszük figyelembe a kiértékelésnél, feltéve hogy az egymást követő referencia kalibrálóstandardok által adott detektorjel között a különbség nagyon kicsi (< 10 %). Ezért az injektálásokat lehetőség szerint megszakítás nélkül kell végezni. Ha a mérést meg kell szakítani, akkor a megszakítás előtti utolsó és a megszakítás utáni első injektálás referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) legyen. Mivel a kalibrációs görbe lineáris és áthalad a nullán, a mintakivonatban található aflatoxin B1 mennyiségét közvetlenül a megfelelő szabványokra utalással határozzák meg.

5.5.1. A HPLC pumpa beállítása

Állítsuk be a HPLC pumpát (4.5.) úgy, hogy a mobil fázis (3.6.) áramlási sebessége 5 μm-es analitikai oszlop esetén 0,5 ml/perc, 3 μm-es oszlop esetén 0,3 ml/perc legyen.

5.5.2. A származékképző reagens pumpájának beállítása

A pumpát (4.7.) úgy állítsuk be, hogy a telített vizes jódoldat (3.7.) áramlási sebessége 0,2 és 0,4 ml/perc között legyen. Irányelvnek tekinthető, hogy a mobil fázis 0,5 ml/perces áramlási sebességéhez 0,4 ml/perc reagens áramlási sebességet, a 0,3 ml/perces áramlási sebességhez pedig 0,2 ml/perc reagens áramlási sebességet célszerű beállítani.

5.5.3. Fluoreszcens detektor

A fluoreszcens detektort (4.11.) állítsuk 365 nm gerjesztési és 435 nm emissziós hullámhosszra (szűrős műszereknél: > 400 nm). A detektorleosztást úgy állítsuk be, hogy a rekorderen 1 ng aflatoxin B1-nek a teljes rekorderkitérés 80 %-a feleljen meg.

5.5.4. Injektor

Valamennyi oldatból 250 μl-es mennyiségeket injektáljunk az injektor gyártója által kiadott használati utasítás szerint.

5.5.5. A kromatográfiás elválasztás ellenőrzése

A kromatográfiás tesztoldatot (3.14.1.) a készülékbe injektáljuk.

5.5.6. A rendszer stabilitásának ellenőrzése

Minden vizsgálatsorozatot megelőzően addig injektáljuk az összehasonlító standardot (3.13.3.), amíg stabil csúcs alatti területeket kapunk. (Megjegyzés: Az egymást követő aflatoxin B1-injektálások által adott detektorjel nem különbözhet 6 %-nál nagyobb értékkel.) Ezután késedelem nélkül végezzük el a linearitás ellenőrzését (5.5.7.).

5.5.7. A linearitás ellenőrzése

Injektáljuk az aflatoxin B1 kalibrálóoldatokat (3.13.1.-3.13.4.). Minden harmadik injektálás a referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) legyen, hogy a detektorjel folyamatos változását (drift) korrigálni lehessen. (Megjegyzés: A referencia kalibrálóoldatra kapott detektorjel változása 90 perc alatt nem haladhatja meg a 10 %-ot.) Korrigáljuk a detektorjel folyamatos változását a 7. szakaszban megadott képlet szerint. A kalibrációs görbének lineárisnak kell lennie, és át kell haladnia az origón a becsült Y érték kétszeres standardhibáján belül. A kapott értékek a nominális értéktől nem különbözhetnek 3 %-ot meghaladó mértékben. Ha ezek a követelmények teljesülnek, késedelem nélkül folytassuk a munkát. Ha a követelmények nem teljesülnek, azonosítsuk és szüntessük meg a hibaforrást, mielőtt továbbhaladnánk.

5.5.8. A mintaextraktok injektálása

Injektáljuk a tisztított mintakivonatokat (5.4.2.2.). Minden második injektálás után ismételjük meg az összehasonlító standard (3.13.3.) injektálását a következő sorrendben: referencia kalibrálóoldat, extrakt, extrakt, referencia kalibrálóoldat, extrakt, extrakt, referencia kalibrálóoldat stb.

6. Megerősítő teszt

6.1. Az extrakt (5.4.2.2.) további kezelése

Az 5.4.2.2. szerinti előkészített extrakthoz adjunk 5 ml nátrium-klorid-oldatot (3.15.1.). Extraháljunk háromszor 2 ml kloroformmal (3.1.), mindannyiszor 1-1 percig rázva a választótölcsérben (4.24.1.). Az egyesített kloroformos extraktot töltsük kb. 1 g nátrium-szulfátra (3.15.2.) egy 10 ml-es kémcsőbe. Használhatunk kis (4 cm átmérőjű) tölcsért, amelynek nyakába kis gyapotvatta dugóra helyeztük a kb.

1 g mennyiségű nátrium-szulfátot. Mossuk át a nátrium-szulfát-réteget néhány ml kloroformmal, és gyűjtsük a mosófolyadékot ugyanabba a kémcsőbe. Pároljuk a kloroformos extraktot szárazra ugyanabban a kémcsőben a fűtőblokk (4.24.2.) alkalmazásával, a maradékot oldjuk vissza 1 ml kloroformban.

6.2. Származékkészítés és vékonyréteg-kromatográfia

Lásd a 76/372/EGK tanácsi irányelv mellékletében az "A" módszer 5.6.2. pontját.

7. Az eredmények kiszámítása

Számítsuk a mintában lévő aflatoxin B1-tartalmat (μg/kg) az alábbi képlettel:

Aflatoxin B1-tartalom (μg/kg) =

m × V

V

× M ×

VfVc

ahol

m m =

P

+ P

× 2 r

st

Pminta = a minta aflatoxin B1 csúcsának területe

P(st1) = a mintát megelőző referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) injektáláskor kapott aflatoxin B1 csúcs alatti területe

P(st2) = a mintát követő referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) injektáláskor kapott aflatoxin B1 csúcs alatti területe

r(st) = a referencia kalibrálóoldatban (3.13.3.) injektált aflatoxin B1 mennyisége

Vm = az injektált minta kivonat térfogata, ml

Vext = az előkészített mintakivonat végtérfogata, figyelembe véve az esetleges hígításokat (5.3.), ml

M = a minta tömege, g

Vf = a Florisil patronra felvitt szűrlet térfogata (5.4.1.2.), ml

Vc = a minta extrahálásához felhasznált kloroform térfogata, ml

Ha az ezen leírásban leírt eljárást követjük, a fenti képlet az alábbiakra egyszerűsíthető:

aflatoxin B1-tartalom, μg/kg = 20 × m

7.1. A számítást a lemért csúcsmagasságok alapján is el lehet végezni.

8. Ismételhetőség

Lásd 10.1.

9. Reprodukálhatóság

Lásd 10.1.

10. Megállapítások

10.1. Pontosság

Egy keveréktakarmányon végzett nemzetközi körvizsgálat [1] az ismételhetőségre és reprodukálhatóságra az 1. táblázatban megadott eredményeket adta. Az ismételhetőség (R) az itt használt fogalommeghatározás szerint azt a legnagyobb viszonyszámot jelenti, amely ugyanazon mintán, ugyanabban a laboratóriumban, hasonló körülmények között kapott két eredmény összehasonlításában 95 %-os valószínűségi szinten nem minősül szignifikánsnak. A reprodukálhatóság fogalommeghatározása a fentiekhez hasonló, de két különböző laboratóriumban kapott eredmény összehasonlítására vonatkozóan. Az ISO 3534-1977, 2.35 [2] és a 89/610/EGK [3] bizottsági határozat értelmében az r és R értékeket az 1. táblázat variációs koefficiensként kifejezve is feltünteti.

1. táblázat

Ismételhetőség és reprodukálhatóság

(15 laboratórium eredményei alapján)

Szint | r | R | CVr [4] | CVR |

(μg/kg) | | | (%) | (%) |

8-14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 |

"CV 10.2. A kloroform (3.1.) stabilitása

A Florisil SPE oszlop adszorpciós jellemzői változhatnak, ha nem etanolt használnak stabilizátorként. Ha az előírt kloroform nem áll rendelkezésre, az adszorpciós tulajdonságokat a 10.3.-mal összhangban ellenőrizni kell.

10.3. Validálás

A módszer helyes alkalmazásáról hiteles anyagmintákon végzett ismételt vizsgálatokkal kell meggyőződni. Ha ilyenek nem állnak rendelkezésre, akkor fortifikált aflatoxinmentes mintákon végzett visszanyerési kísérletekkel kell ellenőrizni a módszer működését. Az eredmények átlagának eltérése a valós értéktől -20 és +10 % közé essen (a valós érték %-ában kifejezve).

+++++ TIFF +++++

1. ábra: Oszlopkészlet összeszerelése

+++++ TIFF +++++

2. ábra: A jóddal végzett származékképzéssel történő folyadékkromatográfiás meghatározás rendszerének folyamatábrája

+++++ TIFF +++++

3. ábra: A hőmérséklet-változás figyelembevétele az aflatoxin B1 válaszban referencia kalibrálóoldat (3.13.3.) rendszeres időközönként történő injektálásával"

[1] Egmond, H. P. van Heisterkamp, S. H. és Paulsch, W. E. (1991), Food additives and Contaminants 8, 17-29.

[2] ISO 3534-1977.

[3] HL L 351., 1989.12.2., 39. o.

[4] "a változatok együtthatója

--------------------------------------------------