32009L0156[1]

A Tanács 2009/156/EK irányelve ( 2009. november 30. ) a lófélék mozgására és harmadik országból történő behozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről (kodifikált változat) (EGT-vonatkozású szöveg)

A TANÁCS 2009/156/EK IRÁNYELVE

(2009. november 30.)

a lófélék mozgására és harmadik országból történő behozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről

(kodifikált változat)

(EGT-vonatkozású szöveg)

I. FEJEZET

ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

1. cikk

Ez az irányelv az élő lófélék tagállamok közötti mozgására és harmadik országból történő behozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételeket határozza meg.

2. cikk

Ezen irányelv alkalmazásában a következő meghatározások alkalmazandók:

a) "gazdaság": mezőgazdasági vagy kiképző létesítmény, istálló, illetve általában bármilyen épület vagy helyiség, ahol bármilyen célból szokás szerint lóféléket tartanak vagy tenyésztenek;

b) "lófélék": vad vagy háziasított állatok a lófélék (beleértve a zebrát is) vagy szamárfélék valamely fajához tartozó állatok, illetve ezek kereszteződéséből származó utódok;

c) "törzskönyvezett lófélék": a lófélék Közösségen belüli kereskedelmét szabályozó tenyésztéstechnikai és származástani feltételekről szóló, 1990. június 26-i 90/427/EGK tanácsi irányelv ( 1 ) által meghatározott módon nyilvántartásba vett lóféle, amely

i. a tenyésztő hatóság vagy az állat származási országának más, a méneskönyvet kezelő vagy az illető állatfajta nyilvántartását végző illetékes hatósága, vagy

ii. versenylovakkal foglalkozó nemzetközi szervezetek által kiadott azonosító okmány révén azonosított;

d) "vágásra szánt lófélék": levágás céljából közvetlenül vagy egy, a 7. cikkben említett, jóváhagyott rendező központon át a vágóhídra szállított lófélék;

e) "tenyésztésre és termelésre szánt lófélék": a c) és d) pontban említett lóféléken kívüli lófélék;

f) "afrikai lópestistől mentes tagállam vagy harmadik ország": bármely tagállam vagy harmadik ország, amelynek érintett területein az előző két év folyamán nem voltak afrikai lópestisre utaló klinikai, szerológiai (nem vakcinázott lófélék esetében) vagy járványtani bizonyítékok, és amelyben az előző 12 hónap során nem vakcináztak a betegség ellen;

g) "bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségek": az I. mellékletben felsorolt betegségek;

h) "hatósági állatorvos": a tagállam vagy harmadik ország központi illetékes hatósága által kijelölt állatorvos;

i) "ideiglenes behozatal": a harmadik országból származó és a Közösség területére a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően - a származási ország egészségügyi helyzetétől függően - meghatározott, 90 napnál rövidebb időszakra beengedett törzskönyvezett lóféle minősítése.

II. FEJEZET

A LÓFÉLÉK TAGÁLLAMOK KÖZÖTTI MOZGÁSÁNAK SZABÁLYAI

3. cikk

A tagállamok csak akkor engedélyezik területükön a törzskönyvezett lófélék mozgását, illetve akkor küldenek másik tagállamba lóféléket, ha azok megfelelnek a 4. és 5. cikkben megállapított feltételeknek.

A rendeltetési tagállamok illetékes hatóságai azonban általános vagy korlátozott mentességet biztosíthatnak az olyan lófélék mozgása tekintetében:

- amelyeket sportolási vagy kedvtelési célokból a Közösség belső határai közelében lévő utak mentén lovagolnak vagy hajtanak,

- amelyek felhatalmazott helyi szervek által szervezett, kulturális vagy hasonló célú eseményeken vagy rendezvényeken vesznek részt a Közösség belső határai közelében,

- amelyeket kizárólag a Közösség belső határai szomszédságában történő ideiglenes legelésre vagy munkára szántak.

Az ilyen felhatalmazással élő tagállamok tájékoztatják a Bizottságot a megadott mentesség tartalmáról.

4. cikk

(1) A vizsgálat idején a lófélék nem mutathatnak betegségre utaló klinikai tünetet. A vizsgálatot a hajóra szállításukat vagy rakodásukat megelőző 48 órán belül kell elvégezni. A törzskönyvezett lófélék esetében azonban ez a vizsgálat - a 6. cikk sérelme nélkül - kizárólag a Közösségen belüli kereskedelemhez szükséges.

(2) A bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségekre vonatkozó (5) bekezdés szerinti követelmények sérelme nélkül a hatósági állatorvos a vizsgálat idején - elsősorban a tulajdonos vagy a tenyésztő nyilatkozata alapján - megbizonyosodik arról, hogy közvetlenül a vizsgálat előtti 15 nap folyamán a lóféle nem érintkezett fertőző vagy ragályos betegségben szenvedő lófélével.

(3) A lóféléket nem szánhatják vágásra fertőző vagy ragályos betegség megszüntetésére irányuló nemzeti program keretében.

(4) A lóféléket a következő módon kell azonosítani:

a) a törzskönyvezett lófélék esetében a 90/427/EGK irányelvben előírt azonosító okmány révén, amely elsősorban azt igazolja, hogy ezen irányelv ezen cikkének (5) és (6) bekezdését és az 5. cikk rendelkezéseit betartották.

Ezen irányelv e cikkének (5) bekezdésében vagy az 5. cikkben előírt tilalmak idejére a hatósági állatorvos felfüggeszti az okmány érvényességét. A törzskönyvezett lóféle levágását követően az okmányt visszaküldik az azt kiállító hatóságnak. Az e pontban foglaltak végrehajtásához szükséges eljárást a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően fogadják el;

b) a tenyésztésre vagy termelésre szánt lófélék esetében a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően meghatározott azonosítási módszer révén.

(5) Az 5. cikkben megállapított követelményeken kívül a lófélék nem származhatnak olyan gazdaságból, amelyre a következő tiltó rendelkezések valamelyike vonatkozik:

a) ha nem vágták le a betegségre fogékony állatfaj összes gazdaságban levő egyedét, a származási gazdaságot érintő zárlat időtartama:

i. a tenyészbénaságra gyanús lófélék esetében a beteg állattal való tényleges vagy lehetséges érintkezéstől számított legalább hat hónap. A mének esetében azonban a tilalmat az állat heréléséig kell alkalmazni;

ii. a takonykór vagy a lovak fertőző agy- és gerincvelő-gyulladásai esetében a szóban forgó betegségben szenvedő lófélék levágásának napjától számított legalább hat hónap;

iii. a fertőző kevésvérűség esetében legalább addig a napig tart, amíg a fertőzött állatok levágását követően, három hónapos időközzel elvégzett két Coggins-próbánál a megmaradt állatok eredményei negatívaknak nem bizonyulnak;

iv. a hólyagos szájgyulladás esetében az utolsó nyilvántartott eset előfordulásától számított legalább hat hónap;

v. a veszettség esetében az utolsó nyilvántartott eset előfordulásától számított legalább egy hónap;

vi. a lépfene esetében az utolsó nyilvántartott eset előfordulásától számított legalább 15 nap;

b) ha a gazdaságban tartott, a betegségre fogékony állatfajokba tartozó összes állatot levágták és a helyiségeket fertőtlenítették, a származási gazdaságot érintő zárlat időtartama 30 nap, attól a naptól számítva, amelyen az állatokat levágták és a helyiségeket fertőtlenítették, kivéve a lépfenét, amikor a zárlat időtartama 15 nap.

A lóversenypályák esetében az illetékes hatóságok eltérhetnek az említett tiltó rendelkezésektől, s tájékoztatják a Bizottságot a megállapított eltérésekről.

Ha egy tagállam önkéntes vagy kötelező programot dolgoz vagy dolgozott ki olyan betegség leküzdésére, amelyre a lófélék fogékonyak, a programot a Bizottság elé terjeszti, Belgium, Dánia, Németország, Írország, Görögország, Spanyolország, Franciaország, Olaszország, Luxemburg, Hollandia, Portugália és az Egyesült Királyság 1990. július 4-ét követő hat hónapon belül, Ausztria, Finnország és Svédország 1995. január 1-jét követő hat hónapon belül, a Cseh Köztársaság, Észtország, Ciprus, Lettország, Litvánia, Magyarország, Málta, Lengyelország, Szlovénia és Szlovákia 2004. május 1-jét követő hat hónapon belül, Bulgária és Románia 2007. január 1-jét követő hat hónapon belül, Horvátország pedig 2013. július 1-jét követő hat hónapon belül ismertetve különösen a következőket:

a) a betegség eloszlása a tagállam területén;

b) a programot életre hívó okok, figyelembe véve a betegség jelentőségét és a program várható hasznát a költségeihez viszonyítva;

c) a földrajzi terület, ahol a programot végrehajtják;

d) a létesítményekben alkalmazandó minősítési kategóriák, az egyes fajok által elérendő normák és az alkalmazandó vizsgálati eljárások;

e) a program ellenőrzését biztosító eljárások;

f) a megteendő lépések arra az esetre, ha egy gazdaság bármilyen okból elveszítené a minősítését;

g) a végrehajtandó intézkedések arra az esetre, ha a programban meghatározott rendelkezések szerint végrehajtott vizsgálatok pozitívnak bizonyulnak;

h) az érintett tagállam területén folytatott kereskedelem megkülönböztetéstől mentes természete a Közösségen belüli kereskedelemre való tekintettel.

A Bizottság megvizsgálja a tagállamok által benyújtott programokat. Amennyiben szükséges, a programokat a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően jóváhagyja. Bármely további, a Közösségen belüli kereskedelemben megkövetelhető általános vagy egyedi biztosíték ugyanezen eljárásnak megfelelően határozható meg. Ezek a biztosítékok nem haladhatják meg a tagállam által a saját területén megkövetelt biztosítékokat.

A tagállamok által benyújtott programok a 21. cikk (3) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően módosíthatók vagy egészíthetők ki. A már jóváhagyott programok, illetve a második albekezdésnek megfelelően meghatározott biztosítékok módosításait és kiegészítéseit ugyanezen eljárásnak megfelelően lehet jóváhagyni.

5. cikk

(1) Az a tagállam, amely nem mentes az afrikai lópestistől, területének azon részéről, amely e cikk (2) bekezdése értelmében fertőzöttnek minősül, csak az (5) bekezdésben meghatározott feltételek mellett szállíthat lóféléket.

(2) Valamely tagállam területének egy része afrikai lópestissel fertőzöttnek minősül, amennyiben:

a) klinikai, szerológiai (nem vakcinázott állatokban), illetve járványtani bizonyítékok az afrikai lópestis jelenlétét mutatták ki az elmúlt két évben; vagy

b) afrikai lópestis elleni vakcinázást végeztek az elmúlt 12 hónapban.

Az afrikai lópestissel fertőzöttnek minősülő területnek legalább a következőkből kell állnia:

a) az egyes fertőzési gócpontoktól mért legalább 100 km sugarú védőkörzet;

b) a védőkörzettől legalább 50 km-re kiterjedő megfigyelési körzet, amelyben az elmúlt 12 hónapban nem végeztek afrikai lópestis elleni vakcinázást.

(3) A (2) bekezdésben említett területeken és körzetekben érvényes, az afrikai lópestis elleni küzdelemre irányuló ellenőrzési szabályokat és intézkedéseket, valamint a vonatkozó eltéréseket az afrikai lópestis elleni küzdelemre irányuló ellenőrzési szabályok és intézkedések meghatározásáról szóló, 1992. április 29-i 92/35/EGK tanácsi irányelv ( 2 ) határozza meg.

(4) A védőkörzetben található összes vakcinázott lovat a 92/35/EGK irányelv 6. cikke (1) bekezdésének d) pontja szerint kell nyilvántartásba venni és megjelölni.

Az azonosító okmánynak, illetve az egészségügyi bizonyítványnak egyértelműen utalnia kell az ilyen jellegű vakcinázásra.

(5) Valamely tagállam a (2) bekezdés második albekezdésében említett területről származó lóféléket csak akkor szállíthat, ha azok megfelelnek az alábbi követelményeknek:

a) tekintettel a kórokozót átvivő rovarok tevékenységére az évnek csak meghatározott időszakaiban szállíthatók, amelyeket a 21. cikk (3) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően kell meghatározni;

b) a 4. cikk (1) bekezdésében említett vizsgálat napján az afrikai lópestis klinikai tüneteitől menteseknek kell lenniük;

c) kétszer, 21 és 30 nap közötti időközzel el kellett végezni rajtuk az afrikai lópestist kimutató próbát a IV. mellékletben leírt módon úgy, hogy a második vizsgálatot a szállítást megelőző 10 nap folyamán kellett elvégezni, melyek során a lófélék:

i. vagy negatív eredményt mutatnak, amennyiben nem vakcinázták őket afrikai lópestis ellen; vagy

ii. azt kellett mutatniuk, hogy az ellenanyagszint nem emelkedett, és hogy a szállítást megelőző két hónap folyamán nem vakcinázhatták őket, amennyiben vakcinázták őket afrikai lópestis ellen.

A 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően és az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság véleményét követően más ellenőrzési módszerek is elismerhetőek;

d) a feladást megelőzően legalább 40 napot karanténállomáson kellett tölteniük;

e) a karantén ideje, valamint a karanténállomás és a feladási hely közötti szállítás alatt meg kellett óvni őket a kórokozót átvivő rovaroktól.

6. cikk

Azok a tagállamok, amelyek a lófélék saját területükön történő mozgása tekintetében a 4. cikk (5) bekezdésében előírtakkal egyenértékű biztosítékokat biztosító, alternatív ellenőrzési rendszert alkalmaznak, viszonossági alapon a 4. cikk (1) bekezdése második mondatának, valamint a 8. cikk (1) bekezdése b) pontjának rendelkezéseitől való eltéréseket biztosíthatnak egymásnak.

Ezekről értesítik a Bizottságot.

7. cikk

(1) A lóféléket a lehető legrövidebb idő alatt, a szállítást végző tagállam által meghatározott időközönként fertőtlenítőszerrel rendszeresen tisztított és fertőtlenített járművekkel vagy konténerekben közvetlenül, vagy a szarvasmarhafélék és a sertések Közösségen belüli kereskedelmét érintő állat-egészségügyi problémákról szóló, 1964. június 26-i 64/432/EGK tanácsi irányelv ( 3 ) 2. cikke (2) bekezdésének o) pontjában "gyűjtőállomásként" meghatározott, jóváhagyott rendező központon keresztül kell elszállítani a származási gazdaságból a rendeltetési helyig. A járműveket úgy kell megtervezni, hogy azokból a lófélék ürüléke, alma és takarmánya a szállítás ideje alatt ne juthasson ki. Az 1/2005/EK rendelet sérelme nélkül, a szállítást olyan módon kell elvégezni, hogy az biztosítsa a lófélék egészségének és jólétének megfelelő védelmét.

(2) A rendeltetési tagállam a 4. cikk (5) bekezdésének némely követelményétől általános vagy korlátozott eltérést engedélyezhet az olyan különleges jellel ellátott állatok tekintetében, amely azt mutatja, hogy vágásra szánták őket, feltéve, hogy a III. melléklettel összhangban, az egészségügyi bizonyítványon szerepel ilyen eltérés.

Ilyen eltérés engedélyezése esetében a vágásra szánt lóféléket egyenesen a kijelölt vágóhídra kell szállítani, és a vágóhídra való érkezésüket követő öt napon belül le kell vágni őket.

(3) A hatósági állatorvosnak nyilvántartásba kell venni a levágott állat azonosító számát vagy azonosító okmányának számát, és el kell küldenie a származási hely illetékes hatóságának - ennek kérésére - az állat levágását hitelesítő igazolást.

8. cikk

(1) A tagállamok biztosítják, hogy:

a) a gazdaságokat elhagyó lóféléket a 4. cikk (4) bekezdésének a) pontjában előírt azonosító okmány, valamint - ha azokat Közösségen belüli kereskedelemre szánták - a II. mellékletben előírt egészségügyi igazolás kíséri;

b) a szállítás idején a tenyésztésre, termelésre és vágásra szánt lóféléket a III. mellékletnek megfelelő egészségügyi bizonyítvány kíséri.

(2) Az egészségügyi bizonyítványt vagy törzskönyvezett lófélék esetében az egészségügyi igazolást a 6. cikk sérelme nélkül a szállításra való berakodást megelőző 48 óra során, vagy pedig legkésőbb az előző munkanapon, a származási és a rendeltetési tagállamok hivatalos nyelveinek legalább egyikén kell kiállítani. Az egészségügyi igazolás vagy az egészségügyi bizonyítvány érvényességi ideje 10 nap. Az egészségügyi igazolás vagy az egészségügyi bizonyítvány egyetlen lapból áll.

(3) A törzskönyvezett lóféléktől eltérő lófélék tagállamok közti mozgása esetében az egész rakományra érvényes egyetlen egészségügyi bizonyítvány is kiállítható az (1) bekezdés b) pontjában említett egyéni bizonyítvány helyett.

9. cikk

A 90/425/EGK irányelvben meghatározott szabályokat alkalmazzák, különös tekintettel a származási helyen végzett vizsgálatokra, és a rendeltetési hely szerinti tagállam által végzett ellenőrzések szervezésére és nyomon követésére, valamint a végrehajtott védintézkedésekre.

10. cikk

Ezen irányelv egységes alkalmazásának biztosításához szükséges mértékben és az illetékes nemzeti hatóságokkal együttműködve, a Bizottság állatorvos szakértői helyszíni ellenőrzéseket végezhetnek. A Bizottság tájékoztatja a tagállamokat az említett helyszíni ellenőrzések eredményeiről.

Azok a tagállamok, amelyek területén az ellenőrzéseket végzik, a szakértőknek feladatuk elvégzéséhez minden szükséges segítséget megadnak.

E cikk alkalmazására vonatkozó általános intézkedéseket a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően állapítják meg.

III. FEJEZET

A LÓFÉLÉK HARMADIK ORSZÁGOKBÓL TÖRTÉNŐ BEHOZATALÁNAK SZABÁLYAI

11. cikk

A Közösségbe behozott lóféléknek meg kell felelniük a 12-16. cikkben megállapított feltételeknek.

12. cikk

(1) A lófélék Közösségbe történő behozatala kizárólag olyan harmadik országokból engedélyezett, amelyek szerepelnek a 21. cikk (2) bekezdésében előírt eljárással összhangban létrehozandó vagy módosítandó jegyzékben.

Az egészségügyi helyzetre, valamint a harmadik ország által a lófélék vonatkozásában nyújtott biztosítékokat figyelembe véve a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárással összhangban lehet elhatározni, hogy a jelen bekezdés első albekezdésben előírt engedély a harmadik ország teljes területére, vagy területének csak egy részére vonatkozzon-e.

Ebből a célból, valamint a vonatkozó nemzetközi előírások alapján figyelembe kell venni azt, hogy a harmadik ország milyen módon alkalmazza és hajtja végre ezen előírásokat, különös tekintettel a régiókba sorolás elvére, saját területén, illetve a más harmadik országokból és a Közösségből történő behozatalra vonatkozó egészségügyi követelményei vonatkozásában.

(2) Az (1) bekezdésben megállapított jegyzék felállításakor vagy módosításakor különösen számításba kell venni az alábbiakat:

a) a harmadik országban a lófélék, egyéb háziasított állatok és vadon élő állatok egészségügyi helyzete, különös tekintettel a trópusi állatbetegségekre, valamint az általános egészségügyi és környezetvédelmi helyzet bármely vonatkozására a harmadik országban, amely veszélyt jelenthet a Közösség egészségügyi és környezetvédelmi helyzetére;

b) a harmadik ország állat-egészségügyi és állatvédelmi jogszabályai;

c) az illetékes állat-egészségügyi hatóság és ellenőrző szolgálatainak megszervezése, e szolgálatok hatáskörei, ezek felügyelete, illetve a rendelkezésükre álló eszközök, beleértve a személyzetet és laboratóriumi kapacitást, melynek segítségével a nemzeti jogszabályokat hatékonyan lehet alkalmazni;

d) a biztosítékok, amelyeket a harmadik ország illetékes állat-egészségügyi hatósága tud nyújtani a Közösségben alkalmazott, vonatkozó állat-egészségügyi feltételek teljesítése, vagy a feltételek egyenértékűsége vonatkozásában;

e) a harmadik ország tagja-e az Állat-egészségügyi Világszervezet, valamint a harmadik ország által a lófélék fertőző vagy ragályos betegségeinek az ország területén tapasztalható jelenlétére vonatkozó adatok szolgáltatásának rendszeressége és gyorsasága, különös tekintettel az Állat-egészségügyi Világszervezet által nyilvántartott, illetve az ezen irányelv I. mellékletében felsorolt betegségekre;

f) a harmadik ország által nyújtott biztosítékok arra vonatkozóan, hogy közvetlenül tájékoztatja a Bizottságot és a tagállamokat:

i. 24 órán belül az I. mellékletben felsorolt, lófélékre vonatkozó fertőző betegségek megjelenése megerősítésétől, valamint az e betegségekre vonatkozó vakcinázási szabályok bármely módosításáról;

ii. megfelelő időn belül a lófélékre, különös tekintettel a lófélék behozatalára vonatkozó nemzeti egészségügyi szabályok bármely tervezett megváltoztatásáról;

iii. rendszeres időközönként a területén tapasztalt, a lófélékre vonatkozó állat-egészségügyi helyzetről;

g) élő lófélék előző behozatalaira vonatkozó tapasztalatok, valamint a behozatalkor elvégzett ellenőrzések eredményei;

h) a harmadik országban a Közösség által elvégzett ellenőrzések és/vagy vizsgálatok eredményei, különös tekintettel az illetékes hatóságok értékeléseinek eredményeire vagy, amenynyiben a Bizottság azt kéri, az illetékes hatóságok által az általuk elvégzett ellenőrzésekről benyújtott jelentés;

i) a harmadik országban, a fertőző vagy ragályos állatbetegségek megelőzésére és ellenőrzésére vonatkozó hatályos előírások és azok végrehajtása, beleértve a lófélék más harmadik országokból történő behozatalára vonatkozó előírásokat.

(3) A Bizottság elérhetővé teszi a nyilvánosság számára az (1) bekezdés szerint elkészített vagy módosított jegyzék frissített változatát.

A jegyzéket ki lehet egészíteni az állat- és közegészségügyi célokra létrehozott egyéb jegyzékekkel, illetve tartalmazhatnak egészségügyi bizonyítványmintákat is.

(4) Minden harmadik országban vagy harmadik országok csoportjában különleges behozatali feltételeket kell megállapítani az érintett harmadik országban vagy országokban a lófélék állat-egészségügyi helyzetére tekintettel, a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően.

(5) Az (1)-(4) bekezdések alkalmazására vonatkozó részletes szabályokat és harmadik országoknak vagy harmadik országok részeinek az (1) bekezdés szerinti jegyzékekbe történő felvételének szempontjait a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően lehet elfogadni.

13. cikk

(1) A lóféléknek olyan harmadik országból kell származniuk, amely:

a) mentes az afrikai lópestistől;

b) két éve mentes a lovak venezuelai agy- és gerincvelő-gyulladásától (VEE);

c) hat hónapja mentes a tenyészbénaságtól és a takonykórtól.

(2) A 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően döntést hozhatnak arról, hogy:

a) az (1) bekezdés rendelkezéseit a harmadik ország területének csupán egy részére kell alkalmazni.

Az afrikai lópestissel kapcsolatos követelmények regionális alkalmazása esetében legalább az 5. cikk (2) és (5) bekezdésében előírt intézkedéseket be kell tartani;

b) kiegészítő biztosítékokat lehessen kérni a Közösségben elő nem forduló betegségekre vonatkozóan.

14. cikk

A lóféléknek a 15. cikk értelmében elfogadandó határozatokban megállapítandó időtartam alatt megszakítás nélkül a harmadik ország területén vagy területének bizonyos részén, illetve - regionalizáció esetén - a 13. cikk (2) bekezdése a) pontjának értelmében meghatározott területrészen kellett tartózkodniuk a rendeltetési tagállamba történő szállításra való berakodás napját megelőzően.

Állat-egészségügyi felügyelet alatt álló gazdaságból kell származniuk.

15. cikk

A lóféléknek a 12. cikk (1) bekezdése szerint összeállított listán szereplő harmadik országok területéről, illetve ezeknek a 13. cikk (2) bekezdése a) pontjának értelmében meghatározott részéről történő behozatalát kizárólag abban az esetben engedélyezik, ha a lófélék a 13. cikk követelményein kívül:

a) megfelelnek a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően elfogadott, az adott harmadik országból származó lófélék behozatalával kapcsolatos állat-egészségügyi követelményeknek, amelyek a lófélék szóban forgó fajaira, kategóriáira vonatkoznak.

Ezen állat-egészségügyi követelmények megállapításában a 4. és 5. cikkekben megállapított követelmények szolgálnak viszonyítási alapul; és

b) a hólyagos szájgyulladástól vagy a fertőző arteritistől legalább hat hónapja nem mentes harmadik ország esetében a lóféléknek a következő követelményeknek kell megfelelni:

i. hólyagos szájgyulladástól legalább hat hónapja mentes gazdaságból származnak, és a szállítást megelőzően elvégzett szerológiai vizsgálatok eredményei negatívnak bizonyultak;

ii. a fertőző arteritis esetében - a 19. cikk b) pontjától eltérően - a hímivarú lóféléken végzett szerológiai vizsgálat, vírusizolálás vagy bármely más, a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően elismert, a vírusmentességet szavatoló vizsgálat eredményei negatívaknak bizonyultak.

A 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően és az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság véleménye alapján határozhatóak meg a hímivarú lófélék azon kategóriái, amelyekre ezt a követelményt alkalmazni kell.

16. cikk

(1) A lóféléket a 4. cikk (4) bekezdése szerint kell azonosítani és olyan kísérő egészségügyi bizonyítvánnyal ellátni, amelyet az exportáló harmadik ország hatósági állatorvosa állított ki. Az egészségügyi bizonyítvány:

a) az állatoknak a rendeltetési tagállamba irányuló szállításra való berakodása napján, illetve - törzskönyvezett lovak esetében - a szállításra való berakodást megelőző utolsó munkanapon kerül kiállításra;

b) a rendeltetési tagállam, valamint a behozatali ellenőrzéseket végző tagállam hivatalos nyelveinek legalább egyikén kerül kiállításra;

c) eredeti példánya kíséri az állatot;

d) tanúsítja, hogy az állatok megfelelnek ezen irányelv követelményeinek és azoknak a követelményeknek, amelyeket ezen irányelv alapján fogadtak el a harmadik országokból származó behozatalra vonatkozóan;

e) egyetlen lapból áll;

f) egyetlen címzett számára, illetve - vágóállatok esetében - az egész szállítmány számára állítják ki, feltéve, ha az állatokat megfelelően megjelölték és azonosították.

Ha a tagállamok élnek ezzel a lehetőséggel, erről tájékoztatják a Bizottságot.

(2) Az egészségügyi bizonyítványt olyan formában kell elkészíteni, amely megfelel a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően meghatározott mintának.

17. cikk

(1) A rendeltetési tagállamba való megérkezésüket követően a vágásra szánt lóféléket - akár közvetlenül, akár egy, a 7. cikkben említett, jóváhagyott rendező központon át - azonnal a vágóhídra kell szállítani, majd az állat-egészségügyi követelményeknek megfelelően, a 15. cikk szerint elfogadandó határozatokban megjelölt időszakon belül le kell vágni.

(2) A 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően esetleg elfogadásra kerülő különleges feltételek sérelme nélkül, a rendeltetési tagállam illetékes hatósága állat-egészségügyi okokból kijelölheti azt a vágóhidat, ahová az ilyen lóféléket szállítani kell.

18. cikk

A tagállamok és a Bizottság állatorvos-szakértői helyszíni ellenőrzések révén igazolják ezen irányelv és különösen a 12. cikk (2) bekezdése rendelkezéseinek gyakorlati alkalmazását.

Amennyiben az e cikk értelmében elvégzett ellenőrzések súlyos, az engedélyezett gazdaság ellen szóló tényeket tárnak fel, a Bizottság azonnal tájékoztatja a tagállamokat és haladéktalanul olyan határozatot hoz, amellyel az engedélyt ideiglenesen felfüggeszti. A végső döntést a 21. cikk (3) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően hozzák meg.

Az ellenőrzések végrehajtásáért felelős tagállami szakértőket a Bizottság jelöli ki a tagállamok javaslata alapján.

Az ellenőrzéseket a Közösség nevében végzik, amely viseli az e körben felmerülő összes költséget.

Az ellenőrzések gyakoriságát és eljárásait a 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően határozzák meg.

19. cikk

A 21. cikk (2) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően:

a) dönthetnek úgy, hogy a harmadik országokból, vagy azok valamely részéből származó behozatalt bizonyos fajokra, lófajták kategóriáira korlátozzák;

b) a 15. cikk ellenére meg kell határozni a törzskönyvezett, illetve a különleges felhasználásra szánt lóféléknek a Közösség területére való ideiglenes behozatalára, illetve - ideiglenes kivitelüket követően - azoknak a Közösség területére való újrabehozatalára vonatkozó különleges feltételeket;

c) meg kell határozni az ideiglenes belépésnek állandó belépéssé történő változtatására vonatkozó feltételeket;

d) ki lehet jelölni egy közösségi referencialaboratóriumot, a lófélék egy vagy több, az I. mellékletben felsorolt betegsége számára, és biztosítani kell a tagállamokban a lófélék fertőző betegségeinek diagnosztizálásáért felelős laboratóriumokkal történő együttműködésre vonatkozó hatásköröket, feladatokat és eljárásokat.

IV. FEJEZET

ZÁRÓ RENDELKEZÉSEK

20. cikk

Az I-IV. mellékleteket a 21. cikk (3) bekezdésében említett eljárásnak megfelelően kell módosítani.

21. cikk

(1) A Bizottságot az élelmiszerjog általános elveiről és követelményeiről, az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság létrehozásáról és az élelmiszerbiztonságra vonatkozó eljárások megállapításáról szóló, 2002. január 28-i 178/2002/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet ( 4 ) 58. cikkével létrehozott élelmiszerlánc- és állat-egészségügyi állandó bizottság segíti.

(2) Az e bekezdésre való hivatkozáskor az 1999/468/EK határozat 5. és 7. cikkét kell alkalmazni.

Az 1999/468/EK határozat 5. cikkének (6) bekezdésében megállapított határidő három hónap.

(3) Az e bekezdésre való hivatkozáskor az 1999/468/EK határozat 5. és 7. cikkét kell alkalmazni.

Az 1999/468/EK határozat 5. cikkének (6) bekezdésében megállapított időtartam 15 nap.

22. cikk

Az V. melléklet A. részében felsorolt jogi aktusokkal módosított 90/426/EGK irányelv hatályát veszti, az V. melléklet B. részében feltüntetett irányelveknek a nemzeti jogba történő átültetésére vonatkozó határidőkkel kapcsolatos tagállami kötelezettségek sérelme nélkül.

A hatályon kívül helyezett irányelvre való hivatkozásokat az erre az irányelvre való hivatkozásként kell értelmezni a VI. mellékletben foglalt megfelelési táblázattal összhangban.

23. cikk

Ez az irányelv az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

24. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.

I. MELLÉKLET

BEJELENTÉSI KÖTELEZETTSÉG ALÁ TARTOZÓ BETEGSÉGEK

A bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségek a következők:

- Tenyészbénaság

- Takonykór

- Lovak fertőző agy- és gerincvelőgyulladásai (valamennyi formája, beleértve a VEE-t)

- Fertőző kevésvérűség

- Veszettség

- Lépfene

- Afrikai lópestis

- Hólyagos szájgyulladás

II. MELLÉKLET

MINTA

EGÉSZSÉGÜGYI IGAZOLÁS ( 5 )

... számú útlevél

Alulírott igazolom ( 6 ), hogy a fent azonosított lóféle megfelel a következő követelményeknek:

a) a mai napon végzett vizsgálat során betegségre utaló tüneteket nem mutatott;

b) nem jelölték ki kényszervágásra ragályos vagy fertőző betegség megszüntetésére irányuló nemzeti program keretében;

c)

- egy tagállam nem olyan területéről, vagy a terület nem olyan részéről származik, amelyre az afrikai lópestis miatt korlátozó intézkedések vonatkoznak, vagy

- a tagállamok olyan területéről, vagy a terület olyan részéről származik, amelyre állat-egészségügyi okokból tiltó intézkedések vonatkoznak, de a ... karanténállomáson ...és ... között kielégítő eredményekkel átesett a 2009/156/EK irányelv 5. cikkének (5) bekezdésében előírt vizsgálatokon ( 7 ),

- nincs oltva afrikai lópestis ellen, vagy

- ... én/án oltották afrikai lópestis ellen (7) ( 8 );

d) nem olyan gazdaságból származik, amelyre állat-egészségügyi okokból tilalom vonatkozik, és nem érintkezett olyan gazdaságban élő lófélékkel, amelyekre a következő állat-egészségügyi okokból tilalom vonatkozik:

- tenyészbénaságra gyanús lófélék esetében a beteg állattal való tényleges vagy lehetséges érintkezéstől számított hat hónapig. A mének esetében a tilalom az állat heréléséig alkalmazandó,

- a takonykór vagy a lovak agy-és gerincvelő-gyulladása esetében a kérdéses betegségben szenvedő lófélék levágásának napjától számított hat hónapig,

- a fertőző kevésvérűség esetében legalább addig a napig, amíg a fertőzött állatok levágását követően kétszeri, három hónapos időközzel elvégzett Coggins-próbában a megmaradt állatok eredményei negatívaknak nem bizonyulnak,

- a hólyagos szájgyulladás esetében az utolsó eset előfordulásától számított hat hónapig,

- a veszettség esetében az utolsó eset előfordulásától számított egy hónapig,

- lépfene esetében az utolsó eset előfordulásától számított 15 napig,

- ha a gazdaságban megállapított betegségre fogékony állatfajok összes egyedét levágták és az épületet fertőtlenítették, az állatok elpusztításának és az épületek fertőtlenítésének napjától számított 30 napig, kivéve a lépfenét, amikor a zárlat időtartama 15 nap;

e) legjobb tudomásom szerint az e nyilatkozatot megelőző 15 napos időszakban nem érintkezett fertőző vagy ragályos betegségben szenvedő lófélékkel;

f) a szemle időpontjában az 1/2005/EK rendelet rendelkezéseivel összhangban a tervezett szállításra alkalmas volt ( 9 ).

III. MELLÉKLET

MINTA

EGÉSZSÉGÜGYI BIZONYÍTVÁNY

Az EK tagállamai közötti kereskedelemhez

LÓFÉLÉK

IV. MELLÉKLET

AFRIKAI LÓPESTIS

DIAGNÓZIS

A. RÉSZ

Szerológiai vizsgálatok

Az alábbiakban leírt szerológiai módszerek ELISA próbák (enzyme-linked immunosorbent assays), amelyek a 2012 májusában az OIE küldöttek világtalálkozója által elfogadott, "A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve" 2016-os kiadása 2.5.1. fejezete B szakaszának 2. pontján alapulnak.

A VP7 vírusfehérje az afrikai lópestis vírus (ALPV) egyik immundomináns major antigénje, és a kilenc ALPV szerotípuson belül megmarad. A rekombináns ALPV-VP7 fehérjék igazoltan stabilak, ártalmatlanok és alkalmasak az antigénként történő felhasználásra az ELISA próbák során az ALPV-ellenes ellenanyagok meghatározására magas fokú szenzitivitás és specificitás mellett (Laviada et al., 1992b ( 10 ); Maree és Paweska, 2005). Az afrikai lópestis (ALP) szerológiai diagnózisára alkalmas ALP-VP7 ELISA próbák közé tartozik az indirekt ELISA és a blokkoló ELISA.

1. Az afrikai lópestis vírusával (ALPV) szemben termelt ellenanyagok kimutatására szolgáló indirekt ELISA próba

Az ennél a módszernél alkalmazott konjugátum a torma-peroxidáz anti-ló gamma-globulin, amely lovak, öszvérek és szamarak szérumával reagál. A Maree és Paweska (2005) ( 11 ) által leírt módszer G-fehérjét használ konjugátumként, amely zebra szérummal is reagál.

Az antigént a spanyolországi Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) biztosítja az igénylést követő 4-6 hónapon belül.

1.1. Vizsgálati eljárás

1.1.1. Szilárd fázis

1.1.1.1. Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

1.1.1.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.1.3. Blokkoljuk a lemezeket 7,2 pH-értékű, foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) és 5 % (w/v) sovány tej (Nestlé Dry Skim MilkTM) lyukanként 200 μl-nyi keverékével egy órán át 37 °C-on.

1.1.1.4. Távolítsuk el a blokkoló oldatot, és finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz.

1.1.2. Vizsgálandó minták

1.1.2.1. A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:25 arányban PBS, 5 % (w/v) sovány tej és 0,05 % (v/v) Tween-20 lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Titráláshoz készítsünk kétszeres hígítási sort 1:25 aránytól kezdve (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

1.1.2.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.3. Konjugátum

1.1.3.1. Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, PBS, 5 % tej és 0,05 % Tween-20 7,2 pH értékű keverékében hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-ló gamma-globulint. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

1.1.3.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.4. Kromogén/szubsztrát

1.1.4.1. Adjunk mindegyik lyukhoz 200 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).

A színképződést kb. 5-10 perccel később 50 μl 3N H2SO4 hozzáadásával állítjuk le (mielőtt a negatív kontrollszérum elszíneződne).

Más kromogének is alkalmazhatók, mint pl. az ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), TMB (tetra-metil benzidin) vagy az OPD (orto-fenildiamin).

1.1.4.2. Olvassuk le a lemezeket 600 (vagy 620) nm-en.

1.2. Az eredmények értékelése

1.2.1. A küszöbértéket úgy számítjuk ki, hogy 0,06-ot hozzáadunk a negatív kontroll értékéhez (0,06 a standard szórás 30 negatív szérumból származtatva).

1.2.2. A küszöbértéknél alacsonyabb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat negatívnak tekintjük.

1.2.3. A küszöbérték + 0,15-nél nagyobb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat pozitívnak tekintjük.

1.2.4. A köztes abszorpciós értéket mutató vizsgált minták kétesnek tekintendők, ezért egy második technikát kell alkalmazni az eredmények megerősítéshez.

2. Az afrikai lópestis vírusával (ALPV) szemben termelt ellenanyagok kimutatására szolgáló blokkoló ELISA próba

A kompetitív blokkoló ELISA próba specifikus ALPV-ellenes antitestek detektálására szolgál a lófélék bármely fajából származó szérumban, ideértve a lovakat, szamarakat, zebrát és azok keresztezéseit, megkerülve az indirekt ELISA próbák során alkalmanként tapasztalt specificitási problémát.

A vizsgálat elve az ELISA-lemezhez kötött rekombináns VP7-fehérje és a konjugált, ALP-VP7-specifikus monoklonális ellenanyag (mea) közötti reakció megszakításán alapul. A vizsgálandó szérumban lévő ellenanyagok gátolják az antigén és a mea közötti reakciót, ami a színintenzitás csökkenését fogja eredményezni. Mivel a mea a VP7 ellen irányul, a próba érzékenysége és specificitása magas fokú.

A kompetitív blokkoló ELISA próba kereskedelmi forgalomban kapható.

2.1. Vizsgálati eljárás

2.1.1. Szilárd fázis

2.1.1.1. Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított, 50-100 ng mennyiségű rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

2.1.1.2. A lemezeket háromszor kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.2. Vizsgálandó minták és kontrollok

2.1.2.1. A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:5 arányban 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween-20 és 0,1 % Kathon lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Titráláshoz készítsünk a vizsgálandó szérumokból kétszeres hígítási sort 1:10 aránytól 1:280 arányig 8 lyukban (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.2.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.3. Konjugátum

2.1.3.1. Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, torma-peroxidázzal konjugált mea anti-VP7-et. Előzetesen ezt a mea-t 1/5 000 -1/15 000 arányban hígították StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Referencia: SZ03) és desztillált víz 1/1 arányú oldatában. 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.3.2. A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.4. Kromogén/szubsztrát

Mindegyik lyukhoz hozzáadunk 100 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (1 ml ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), 5 mg/ml, + 9 ml szubsztrát puffer (0,1 M 4 pH-értékű, 0,03 % H2O2-t tartalmazó foszfát-citrát puffer), és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A színképződést lyukanként 100 μl 2 % (w/v) SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával állítjuk le.

2.1.5. Leolvasás

Olvassuk le ELISA-leolvasóban 405 nm-en.

2.2. Az eredmények értékelése

2.2.1. Határozzuk meg minden egyes minta blokkoló százalékát (BSz) a következő képlet használatával, amelynél az "Ea" ellenanyagot jelöl:

2.2.2. Az 50 %-nál magasabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra pozitívnak tekintendők.

2.2.3. A 45 %-nál alacsonyabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra negatívnak tekintendők.

2.2.4. A 45-50 % közötti BSz értékeket mutató minták kétesnek tekintendők, és újra kell azokat vizsgálni. Amennyiben az eredmény ismételten kétes, a kétes minta vételétől számított legalább két hét elteltével az állatoktól újabb mintát kell venni.

B. RÉSZ

A kórokozó azonosítása

Valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (rRT-PCR)

A nukleinsav módszereken alapuló kórokozó azonosító vizsgálatoknak az ALPV kilenc szerotípusából származó referencia törzseket kell felismernie.

A 2.1. pontban leírt módszer "A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve", 2016-os kiadása 2.5.1. fejezete B. szakaszának 1.2. pontján alapul, ahogy azt 2012 májusában elfogadta az OIE delegáltak világtalálkozója.

A minták - legyen az vér vagy lép - vizsgálatára használt, bármely RT-PCR detektálási módszernek a 2009/156/EK irányelv szerint a 2. pontban leírt módszertanokéval azonos érzékenységet kell teljesítenie vagy meghaladnia azt.

Az 1-9 szerotípusú referenciatörzsekbe tartozó inaktivált vírusok az Európai Unió referencialaboratóriumától, illetve az OIE afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriumától (Algete, Spanyolország) szerezhetők be.

1. A vírus RNS extrakciója

A jó reakció biztosítása érdekében magas minőségű ALPV RNS kinyerése szükséges a mintából. A klinikai mintákból a nukleinsavak extrakciója számos házon belüli és kereskedelmi forgalomban kapható módszer segítségével végezhető.

A kereskedelmi készletek különböző megközelítéseket alkalmaznak az RNS izoláláshoz. Legnagyobb részük az alábbi eljárások valamelyikén alapul:

- a nukleinsavak fenol-kloroform extrakciója;

- a nukleinsavak adszorpciója egy filter rendszerre;

- a nukleinsavak adszorpciója egy mágneses gyöngy-rendszerre;

A házon belüli RNS extrakció egy példája az alábbiakban található:

1.1. 1 g szövetmintát 1 ml denaturáló oldatban (4 M guanidium-tiocianát, 25 mM nátrium-citrát, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarcosyl) homogenizálunk.

1.2. A centrifugálást követően a felülúszóhoz hozzáadjuk 1 μg élesztő RNS, 0,1 ml 2 M-os, 4 pH-értékű nátrium-acetát, 1 ml fenol és 0,2 ml kloroform/izoamil-alkohol keverékét (49/1).

1.3. A szuszpenziót erősen felrázzuk, majd 15 percig jégen hűtjük.

1.4. A centrifugálást követően a vizes fázisban jelenlévő RNS-t fenollal kivonjuk, etanollal precipitáljuk, majd steril vízben újraszuszpendáljuk.

2. Valós idejű RT-PCR eljárás

2.1. Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Agüero et al., 2008 szerint ( 12 )

Ez a csoportspecifikus valós idejű RT-PCR az ALPV VP7 fehérjéjét célozza meg, és képes detektálni minden ismert, jelenleg cirkuláló ALPV szerotípust és törzset. Nagyon jó eredményekkel alkalmazták ezt a módszert az Európai Unió tagállamainak résztvevő nemzeti referencialaboratóriumai az Európai Unió referencialaboratóriuma által 2009-2015 közötti időszakban évente szervezett jártassági teszteken. Ezenfelül az OIE referencialaboratóriumok hálózata keretében 2015-ben szervezett nemzetközi körvizsgálatban ezt a protokollt nagyon magas helyre sorolták a többi között.

Az ALPV vírusfajok detektálásához a primer és próba szekvenciák az alábbiak:

forward primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

reverse primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

MGB-TaqMan próba

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1. A primer törzskoncentrációt 8 μM munkakoncentrációra hígítjuk ("8 μM primer munkatörzs"), a próbát pedig 50 μM munkakoncentrációra hígítjuk ("50 μM próba munkatörzs"). Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, minden egyes 8 μM-os primer törzsoldatból 2,5 μl-nyit (végső koncentráció 1 μM) hozzáadunk minden egyes lyukhoz, amely RNS mintákat, pozitív és/vagy negatív kontrollokat fog tartalmazni (a primer oldat végső koncentrációja 1 μM 20 μl RT-PCR oldatban). A lemezt jégen tároljuk.

2.1.2. Az izolált RNS (tesztminták és pozitív kontroll) 2 μl-jét, illetve negatív reakciós kontrollok esetén 2 μl RNáz-mentes vizet keverünk el a forward és reverse primerekkel. Ezt a keveréket 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 5 percig.

2.1.3. A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. Minden RNA-mintát tartalmazó lyukhoz 0,1 μl 50 μM-os próba törzsoldatot adunk (a próbaoldat koncentrációja 0,25 μM minden RNA-mintát tartalmazó lyuk esetében). A valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeverékből 13 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket és RNS-t tartalmazó PCR lemezen.

2.1.4. A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük. Az amplifikációs körülmények a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 25 percig, majd 10 percig 95 °C-on ("forró start"), ezután egy 95 °C-on 15 másodpercből, 55 °C-on 35 másodpercből és 72 °C-on 30 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve (vagy 40 ciklusnyi 97 °C 2 másodpercig és 55 °C 30 másodpercig, amennyiben gyors reakciókat lehetővé tevő reagenseket és a termocyler-t használnak). A fluoreszcencia adatokat az 55 °C-os lépés végén vesszük fel.

2.1.5. A vizsgálat érvénytelennek tekintendő, ha atípusos amplifikációs görbéket kaptunk, és meg kell azt ismételni.

A minták pozitívnak tekintendők, ha a Ct érték (azon ciklus száma, amelynél a reakcióban generált fluoreszcencia meghaladja a fluoreszcencia küszöbértéket) kisebb vagy egyenlő a meghatározott Ct küszöbértékkel (35) 40 PCR cikluson belül (Ct ≤ 35).

A minták kétesnek tekintendők, ha a Ct érték magasabb mint a meghatározott Ct küszöbérték (35) 40 PCR cikluson belül (Ct > 35).

A minták negatívnak tekintendők, ha egy horizontális amplifikációs görbét nyerünk, amely nem keresztezi a küszöbvonalat 40 PCR cikluson belül.

2.2. Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Guthrie et al., 2013 szerint ( 13 )

Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) próbákat használó valós idejű RT-PCR az ALPV nukleinsav detektálására.

A leírt ALPV RT-PCR vizsgálatot úgy tervezték, hogy az ALPV számos, jelenleg cirkuláló vad törzséből származó szekvenciát használjon (Quan et al., 2010 ( 14 )). Védett szintetikus külső kontrolltesztet is magában foglal a vizsgálati elemek megfelelő működésének verifikálása céljából.

Az egylépcsős valós idejű PCR-hoz való készletek kereskedelmi forgalomban kaphatók. Az alábbiakban néhány alaplépés látható a Guthrie et al. (2013) által leírtaknak megfelelően, amelyek módosíthatók a helyi/esetspecifikus igények, a használt készletek és a rendelkezésre álló készülékek függvényében

Az ALPV vírusfajok detektálásához a primer és próba szekvenciák az alábbiak:

forward primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

reverse primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

MGB-TaqMan próba

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1. A primer és próba keverék törzsoldatokat 25x, 5 μΜ-os koncentrációban készítjük el a forward és reverse primerek esetén, 3 μΜ-osan pedig a próba esetében. Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, RNS mintákból 5 μl-t, beleértve a tesztmintákat, valamint pozitív és negatív kontrollokat, hozzáadunk a lemez megfelelő lyukaihoz a tervet követve.

2.2.2. Az RNS-t 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 3 percig.

2.2.3. A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. 1 μl 25× primer próba keverék törzsoldatot (a fenti 2.2.1. pontból) adunk a mesterkeverékhez, így minden egyes lyukban 200 nM-os végleges koncentrációt érünk el minden primer és 120 nM-t a próba esetében. A mesterkeverékből 20 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket tartalmazó PCR lemezen.

2.2.4. A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük a gyártó javaslata szerint. Az amplifikációs körülmények például a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 10 percig, majd 95 °C-on 10 percig, ezután 95 °C-on 15 másodpercből és 60 °C-on 45 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve.

2.2.5. A minták pozitívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában.

A minták kétesnek tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36-40 PCR ciklus között a minta bármely replikátumában.

A minták negatívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az RT-PCR vizsgálatnál nem haladta meg a 0,1-es küszöböt 40 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában, és ha a normalizált fluoreszcencia a védett szintetikus külső kontrollteszt esetében meghaladja a 0,1-es küszöböt 33 PCR cikluson belül.

V. MELLÉKLET

A. RÉSZ

A hatályon kívül helyezett irányelv és egymást követő módosításainak listája

(lásd a 22. cikket)

B. RÉSZ

A nemzeti jogba való átültetésre előírt határidők listája

(lásd a 22. cikket)

VI. MELLÉKLET

Megfelelési táblázat

( 1 ) HL L 224., 1990.8.18., 55. o.

( 2 ) HL L 157., 1992.6.10., 19. o.

( 3 ) HL 121., 1964.7.29., 1977. o.

( 4 ) HL L 31., 2002.2.1., 1. o.

( 5 ) Ez az igazolás nem szükséges a 2009/156/EK irányelv 6. cikkével összhangban kötött kétoldalú egyezmények esetében.

( 6 ) 10 napig érvényes.

( 7 ) A nem megfelelő rész törlendő.

( 8 ) A vakcinázás dátumát fel kell tüntetni az útlevélben.

( 9 ) Ez a nyilatkozat nem mentesíti a fuvarozókat a hatályos közösségi rendelkezések szerinti, különösen pedig a szállítandó állatok alkalmasságára vonatkozó kötelezettségeik alól.

( 10 ) Laviada M.D., Roy P. and Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646-650.

( 11 ) Maree S. and Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55-65.

( 12 ) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325-328.

( 13 ) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-5.

( 14 ) Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45-52.