32001R0213[1]

A Bizottság 213/2001/EK rendelete (2001. január 9.) a tej és tejtermékek elemzése és minőségértékelése tekintetében az 1255/99/EK tanácsi rendelet alkalmazása részletes szabályainak megállapításáról, valamint a 2771/1999/EK és a 2799/1999/EK rendelet módosításáról

A Bizottság 213/2001/EK rendelete

(2001. január 9.)

a tej és tejtermékek elemzése és minőségértékelése tekintetében az 1255/99/EK tanácsi rendelet alkalmazása részletes szabályainak megállapításáról, valamint a 2771/1999/EK és a 2799/1999/EK rendelet módosításáról

AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,

tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,

tekintettel a tej- és tejtermékpiac közös szervezéséről szóló, 1999. május 17-i 1255/1999/EK tanácsi rendeletre [1] és különösen annak 10. és 15. cikkére, 26. cikkének (3) bekezdésére, 29. cikkének (1) bekezdésére és 31. cikkének (14) bekezdésére,

mivel:

(1) Az 1216/68/EGK, a 3942/92/EGK, a 86/94/EK, a 2721/95/EK, az 1080/96/EK, az 1081/96/EK, az 1082/96/EK, az 1854/96/EK, a 880/98/EK, valamint az 1459/98/EK bizottsági rendelet - amelyekre a teljes körű hivatkozás ennek a rendeletnek a XXVI. mellékletében található meg - megállapítja a tej és tejtermékek elemzésére és minőségértékelésére vonatkozó referencia-módszereket és rutinmódszereket, továbbá meghatározza ezeknek a módszereknek a hatályát, valamint alkalmazásuk szabályait. Az egyértelműség érdekében, valamint abból a célból, hogy az ágazatban tevékenykedők számára egységes módszereket és azok alkalmazására vonatkozó szabályokat biztosítsanak, a fent említett rendeletek átdolgozására és tartalmuknak egyetlen szövegben való összefoglalására van szükség. Ugyanezen oknál fogva, módosítani kell a vaj- és tejszínpiacon az intervencióra vonatkozóan az 1255/1999/EK [2] tanácsi rendelet alkalmazásával kapcsolatos részletes szabályok megállapításáról szóló, 1999. december 16-i 2771/1999/EK bizottsági rendeletet, valamint a takarmányozásra szánt fölözött tejre és sovány tejporra és az ilyen sovány tejpor értékesítéséhez nyújtott támogatásra vonatkozóan az 1255/1999/EK tanácsi rendelet alkalmazásával kapcsolatos részletes szabályok megállapításáról szóló, 1999. december 17-i 2799/1999/EK [3] bizottsági rendeletet olyan módon, hogy az azokhoz a rendeletekhez csatolt, elemzési módszerekre vonatkozó mellékleteket e rendelet tartalmazza.

(2) Az 1255/1999/EK rendeletben megállapított intézkedések alapján a tejre és tejtermékekre vonatkozó összetételi és minőségi követelményeket ellenőrizni kell annak érdekében, hogy biztosítsák ezen követelmények szigorú betartását.

(3) Az ilyen ellenőrzésekre vonatkozó referenciamódszerek gyakran olyan nemzetközi szervezetek által közzétett módszerek, mint a CEN, az IDF, az ISO és az AOAC International, és amelyeket a nevezett szervezetek rendszeresen frissítenek. Egyes esetekben sor kerül közösségi referenciamódszer megállapítására, míg más esetekben a közösségi szabályokban referencia-módszert nem határoztak meg. A referencia-módszerek egységes alkalmazásának biztosítása érdekében a referencia-módszerek listáját minden évben össze kell állítani és csak az ebben a felsorolásban szereplő módszerek alkalmazhatók.

(4) A rutinmódszerek alkalmazását nem szabad kizárni. Ennek érdekében azok használatának feltételeit meg kell határozni.

(5) Közös módszereket kell megállapítani annak érdekében is, hogy az elemzések eredményeinek értékelését, az érintett termékek érzékszervi értékelését, és a vitatott eredmények ismételt vizsgálatát egyöntetű gyakorlat alapján lehessen elvégezni.

(6) Egyes elemzések esetében jelenleg nincs nemzetközi szinten elfogadott és érvényesített referencia-módszer, és ezért az elemzési eredményeknek a laboratóriumok közötti szórásáról információ nem áll rendelkezésre. Ezért közösségi módszerek megállapítására van szükség, amelyeket nemzetközileg elfogadott szabályok alapján érvényesítettek, és amelyeket referencia-módszerként alkalmaznak.

(7) A legutóbb a 635/2000/EK rendelettel [4] módosított, a vaj csökkentett áron történő értékesítéséről, valamint a cukrászati termékek, jégkrém és egyéb élelmiszerek előállításánál felhasznált tejszínre, vajra és vajkoncentrátumra vonatkozó támogatás nyújtásáról szóló, 1997. december 15-i 2571/97/EK bizottsági rendelet [5] rendelkezik a tejszín, vaj és vajkoncentrátum egyes körülmények között történő nyomon követéséről, annak érdekében, hogy biztosítsák az ilyen termékek helyes végfelhasználását. Mivel a nyomon követés fontos a rendszer megfelelő működésének biztosítására, és annak érdekében, hogy az abban részt vevő piaci szereplők egyenlő bánásmódban részesüljenek, közös módszereket kell kialakítani egyes ilyen jelölőanyagok meghatározására.

(8) A legutóbb a 101/1999/EK rendelettel módosított [6], a vajkoncentrátum formájában közvetlen fogyasztásra szánt intervenciós vaj csökkentett áron való értékesítéséről szóló, 1985. november 11-i 3143/85/EGK bizottsági rendelet [7], a legutóbb a 124/1999/EK rendelettel [8] módosított, a Közösségben közvetlen fogyasztásra szánt vajkoncentrátumra vonatkozó támogatás pályázati felhívás útján történő nyújtásáról szóló, 1990. február 20-i 429/90/EGK bizottsági rendelet [9] és a 2571/97/EK rendelet értelmében a vajkoncentrátumnak felügyelet mellett hozzáadott jelölőanyagot kell tartalmaznia. A vajkoncentrátum nyomon követésére vonatkozó követelmények teljesítését szigorúan be kell tartatni annak biztosítása érdekében, hogy a termékek ne térjenek el a rendeltetésüktől. Ezért közös módszert kell megállapítani az ilyen jelölőanyagok kimutatására.

(9) Az 1255/1999/EK rendelet 9. cikke értelmében a juhtejből készült sajtok magántárolására támogatás nyújtható. Ugyanezen termékekre különleges visszatérítés is adható az említett rendelet 31. cikkének értelmében. A juhtejből, kecsketejből vagy bivalytejből, illetve a juh-, kecske- és bivalytej keverékéből készült sajtok a Közösség területére egyes harmadik országokból kedvezményes feltételek mellett hozhatók be. A fenti rendelkezésekre tekintettel megfelelő ellenőrző vizsgálatokra van szükség annak biztosítására, hogy az érintett termékek tehéntejet nem tartalmaznak. Ezért meg kell határozni egy közösségi referencia-módszert a tehéntej kimutatására a rutinmódszerek használatának sérelme nélkül, feltéve hogy az ilyen rutinmódszerek megfelelnek egyes kritériumoknak.

(10) A legutóbb a 2654/1999/EK rendelettel [10] módosított, a kazeinok és kazeinátok előállítására szánt fölözött tejre nyújtható támogatásról szóló, 1990. október 10-i 2921/90/EGK bizottsági rendelet [11] értelmében a kólibaktériumoktól való mentességet ki kell mutatni. A tejben és tejtermékekben található kólibaktériumok kimutatására a nemzetközileg elfogadott referencia-módszer az IDF 73A: 1985 nemzetközi szabvány. Azonban egyes termékmennyiségekben található kólibaktériumok kimutatására ez a szabvány csupán módosításokkal alkalmazható. Ezért egy közösségi referencia-módszer kialakítására került sor a fent említett szabvány alapján.

(11) A legutóbb a 254/2000/EK rendelettel [12] módosított, a vám- és statisztikai nómenklatúráról, valamint a Közös Vámtarifáról szóló, 1987. július 23-i 2658/87/EGK tanácsi rendelet [13] rendelkezik a 2309 vámtarifaszám alá tartozó összetett takarmányokra vonatkozó - azok tejterméktartalmától függő - különböző vámtételekről. Annak biztosítása érdekében, hogy a szóban forgó szabályokat egységesen alkalmazzák, a tejcukortartalom elemzésére a tagállamokban kötelezően alkalmazandó, általánosan elismert módszert kell meghatározni.

(12) Az 1255/1999/EK rendelet értelmében az intervencióra szánt vajnak és sovány tejpornak, valamint az állati takarmányozásra szánt sovány tejpornak meg kell felelnie bizonyos minőségi követelményeknek. Referencia-módszereket kell meghatározni a követelmények teljesítésének igazolására.

(13) Az e rendelet által elsőként bevezetett egyes módszerek alkalmazásához egy alkalmazkodási időszakra van szükség. Ezért ezeknek a módszereknek az alkalmazását el kell halasztani.

(14) A Tej- és Tejtermékekpiaci Irányítóbizottság elnöke által kitűzött határidőn belül nem nyilvánított véleményt,

ELFOGADTA EZT A RENDELETET:

I. FEJEZET

ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

1. cikk

Hatály és alkalmazási terület

E rendelet megállapítja a tej- és tejtermékpiac közös szervezéséről szóló, 1255/1999/EK rendeletben foglalt előírások alapján a tej és tejtermékek kémiai, fizikai, mikrobiológiai elemzéséhez, illetve érzékszervi vizsgálatához szükséges módszerek alkalmazásának szabályait. Továbbá meghatároz néhányat ezek közül a módszerek közül.

2. cikk

A módszerek felsorolása

(1) Ennek a rendeletnek az I. melléklete tartalmazza az 1. cikkben említett elemzésekhez alkalmazandó referencia-módszerek felsorolását.

(2) A Bizottság ezt a felsorolást évente legalább egyszer az 1255/1999/EK rendelet 42. cikkében foglalt eljárásnak megfelelően frissíti.

3. cikk

Rutinmódszerek

A közösségi szabályok által megkövetelt elemzésekhez rutinmódszerek is alkalmazhatók, feltéve hogy ezeket kellően kalibrálják és a megfelelő referencia-módszerrel rendszeresen ellen- őrzik.

A II. mellékletben meghatározott eljárás alkalmazható a rutinmódszerekkel kapott olyan eredmények ellenőrzésére, amelyek az érintett rendeletekben meghatározott határértékekhez közel esnek.

Vitás esetekben a referencia-módszerrel nyert eredmények lesznek az irányadóak.

4. cikk

A referencia-módszerek érvényesítése

(1) A referencia-módszereket érvényesíteni kell, amennyiben megfelelnek az ismételhetőségi és reprodukálhatósági határok tekintetében az előre meghatározott pontossági feltételnek.

(2) Amennyiben az érintett rendeletekben megállapított valamely referencia-módszer érvényesítésére nem került sor, a tagállamok ideiglenes reprodukálhatósági határértéket állíthatnak fel.

Ezt a határértéket a III. melléklet b) pontjában említett eljárás szerint kell meghatározni. E rendeletnek a hatálybalépését követő első 18 hónap során azonban a tagállamok ezzel egyenértékű eljárást is alkalmazhatnak.

A határérték betartását évente legalább egyszer kell ellenőrizni.

(3) Amennyiben az érvényesített referencia-módszer vagy az ideiglenes pontossági határértékekkel ellátott módszerek alkalmazásával nyert eredmények azt jelzik, hogy a határérték túllépésére került sor, az elemzési eredményeket a IV. mellékletben meghatározott módszer alkalmazásával lehet értékelni az érintett határértéktől való kritikus eltérés meghatározása érdekében.

5. cikk

Az elemzés eredményeinek elfogadhatósága

(1) Az elemzéseket az V. melléklet a) pontjában meghatározott belső minőségellenőrzési eljárás vagy azzal egyenértékű egyéb szabványos módszer alapján működő laboratóriumok végzik.

Az alkalmazott módszer részletes leírásának - konzultációs célból - a laboratóriumban rendelkezésre kell állnia.

(2) A laboratóriumok saját, házon belüli pontossági értékeiket egy-egy sorozaton belül az összes módszerre vonatkozóan a következők szerint határozzák meg:

a) az V. melléklet b) pontjában megadott módszer alapján; vagy

b) egy megállapított ismételhetőségi értékkel rendelkező, nyilvánosságra hozott, érvényesített másik eljárás alapján.

A reprodukálhatósági határok betartását évente legalább egyszer kell ellenőrizni a III. melléklet a) pontjában meghatározott eljárás alkalmazásával.

A második albekezdés nem vonatkozik azokra a laboratóriumokra, amelyek az adott évben részt vettek egy szakmai alkalmassági vizsgálatban.

(3) Az elemzési eredmények laboratóriumi jegyzőkönyveinek elegendő információt kell tartalmazniuk az eredményeknek a III. és IV. melléklet szerinti értékeléséhez.

(4) Az elemzési eredmények elfogadhatónak tekinthetők, ha azokat az (1) bekezdésben említett belső minőségellenőrzési eljárásban meghatározott elfogadhatósági kritériumoknak és a (2) bekezdésben említett házon belüli pontossági szinteknek megfelelően kapták.

6. cikk

Érzékszervi értékelés

(1) A vaj esetében a VI. mellékletben meghatározott eljárásokat kell alkalmazni a bírálók teljesítményének, valamint a kapott eredmények megbízhatóságának ellenőrzésére. Az érzékszervi vizsgálatok referencia-módszereként a VII. mellékletben meghatározott eljárást kell alkalmazni.

(2) A tej és tejtermékek esetében - a vaj kivételével - tagállamok által kötelezően használt referencia-módszer vagy a 99C/1997 IDF-szabvány, vagy egyéb, ezzel egybevethető módszer lesz, amelyről értesítik a Bizottságot.

A VI. mellékletben meghatározott eljárásokat lehet alkalmazni a bírálók teljesítményének, valamint a kapott eredmények megbízhatóságának ellenőrzésére.

7. cikk

A mintavétel és az elemzési eredmények vitathatósága

(1) A közösségi szabályok szerinti kötelező elemzésekhez ellenmintát kell venni.

(2) A VIII. mellékletben meghatározott módszert kell alkalmazni olyan esetekben, ahol az elemzés eredményét a piaci szereplő nem fogadja el.

II. FEJEZET

ELEMZÉSI MÓDSZEREK

8. cikk

A vaj víz-, zsírmentes szárazanyag- és zsírtartalma

(1) A IX. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vaj víztartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

(2) A X. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vaj zsírmentes szárazanyag-tartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

(3) A XI. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vaj zsírtartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

9. cikk

Jelölőanyagok

(1) A XII. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vajkoncentrátum, a vaj és a tejszín vanillintartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

(2) A XIII. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vajkoncentrátum és a vaj béta-apo-8′ karotinsav etil-észter-tartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

(3) A XIV. mellékletben meghatározott elemzési módszert kell a vajkoncentrátum és a vaj β-szitoszterin- vagy sztigmaszterintartalmának meghatározására szolgáló referencia-módszerként alkalmazni.

(4) A vajkoncentrátumnak, a vajnak és a tejszínnek a nyomonkövetése akkor van összhangban a közösségi szabályokkal, ha a kapott eredmények megfelelnek az (1), (2), illetve (3) bekezdésben említett mellékletek 8. pontjában foglalt meghatározásoknak.

10. cikk

A tehéntejkazein kimutatása

(1) A XV. mellékletben meghatározott elemzési referencia-módszert kell használni annak biztosítására, hogy az olyan sajtok, amelyek csak és kizárólag juhtejből, kecsketejből, bivalytejből, illetve juhtej, kecsketej és bivalytej keverékéből készülhetnek, ne tartalmazzanak tehéntejkazeint.

A tehéntejkazeint akkor tekintjük a mintában jelenlévőnek, ha az elemezni kívánt minta tehéntejkazein-tartalma egyenlő vagy nagyobb, mint a XV. mellékletben meghatározott, 1 % tehéntejet tartalmazó referenciaminta tehéntejkazein-tartalma.

(2) A tehéntejkazeinnek az (1) bekezdésben említett sajtokban történő kimutatására rutinmódszert is lehet alkalmazni, feltéve hogy:

a) a módszer kimutatási határa 0,5 % vagy kevesebb;

b) nem ad hamis pozitív eredményt;

c) a tehéntejkazein megfelelő érzékenységgel még hosszabb érlelési időszakot követően is kimutatható, úgy ahogy a szokásos kereskedelmi körülmények mellett előfordulna.

Amennyiben a b) pontban meghatározott feltétel nem teljesül, minden pozitív eredményt mutató mintát a referencia-módszerrel kell elemezni.

Amennyiben a c) pontban meghatározott feltétel az (1) bekezdésben említett egyik sajttípusra nem teljesül, azt a sajttípust a referencia-módszerrel kell elemezni.

11. cikk

Kólibaktériumok kimutatása

(1) A XVI. mellékletben meghatározott elemzési referenciamódszert kell alkalmazni a kólibaktériumok kimutatására vajból, sovány tejporból, kazeinból és kazeinátokból.

(2) A kólibaktériumok kimutatására rutinmódszerek is alkalmazhatók, feltéve hogy a kapott eredmények egybevethetők a fent említett mellékletben meghatározott referencia-módszerrel kapott eredményekkel. A rutinmódszereknek különösen megfelelő szintű kimutatási határral kell rendelkezniük. Hamis negatív eredmény nem fordulhat elő. Ha a hamis pozitív eredmény előfordulásának lehetőségét nem lehet kizárni, minden pozitív eredményt a referencia-módszer alkalmazásával kell megerősíteni.

12. cikk

Tejcukortartalom

A 2309 KN-kód alá tartozó termékek tejcukortartalmát a XVII. mellékletben meghatározott módszer szerint kell meghatározni.

13. cikk

Oltóssavó kimutatása

(1) Az oltóssavónak az intervenciós raktározásra szánt sovány tejporban való kimutatására szolgáló módszert a XVIII. melléklet tartalmazza.

(2) Az oltóssavónak az állati takarmányozásra szánt sovány tejporban, illetve keverékekben történő kimutatására szolgáló módszert a XIX. melléklet tartalmazza.

14. cikk

Író kimutatása

Az írónak a sovány tejporban való kimutatására szolgáló módszer leírását a XX. melléklet tartalmazza.

15. cikk

Antimikrobiális maradványanyagok

Az antibiotikum- és a szulfonamid/dapson-maradványoknak a sovány tejporban való kimutatására szolgáló módszer leírását a XXI. melléklet tartalmazza.

16. cikk

Soványtejpor-tartalom

Az összetett takarmányok soványtejpor-mennyiségének meghatározására szolgáló módszer leírását a XXII. melléklet tartalmazza.

17. cikk

Keményítő kimutatása

A keményítőnek a sovány tejporban, denaturált tejporban és összetett takarmányokban való kimutatására szolgáló módszer leírását a XXIII. melléklet tartalmazza.

18. cikk

Savanyú írópor nedvességtartalma

A takarmányokban való felhasználásra szánt savanyú írópor nedvességtartalmának kimutatására szolgáló módszer leírását a XXIV. melléklet tartalmazza.

19. cikk

Idegen zsírok kimutatása

Az idegen zsíroknak a tejzsírban való kimutatására szolgáló módszer leírását a XXV. melléklet tartalmazza.

III. FEJEZET

ZÁRÓ RENDELKEZÉSEK

20. cikk

A 2771/1999/EK rendelet módosítása

A 2771/1999/EK rendelet a következőképpen módosul:

1. A 4. cikk (1) bekezdésének első mondata helyébe a következő rendelkezés lép: "A hatáskörrel rendelkező hatóságok az I. mellékletben meghatározott elemzési módszerek felhasználásával és a IV. mellékletben meghatározott szabályokkal összhangban vett minták alapján ellenőrzik a vaj minőségét."

2. Az I. mellékletben a 2. lábjegyzet helyébe a következő rendelkezés lép: "Lásd a 213/2001/EK rendelet I. mellékletét".

3. A II. és III. mellékletet el kell hagyni.

4. A IV. melléklet 2. pontjában, az utolsó előtti mondatban a "III. melléklettel" szavak helyébe a "213/2001/EK rendelet VII. mellékletével" szavak lépnek.

21. cikk

A 2799/1999/EK rendelet módosítása

A 2799/1999/EK rendelet a következőképpen módosul:

1. A 20. cikk (1), (2), (3), valamint (4) bekezdése helyébe a következő rendelkezés lép:

"(1) A keverékek és az összetett takarmányok soványtejpor-tartalmának meghatározását minden mintán legalább kétszer kell elvégezni a 213/2001/EK rendelet XXII. mellékletében meghatározott elemzési módszer alkalmazásával, az e rendelet 17. cikkének (3) bekezdésében említett ellenőrzésekkel kiegészítve. Amennyiben ezeknek az ellenőrzéseknek az eredményében eltérés mutatkozik, a helyszíni ellenőrzés eredménye számít döntőnek.

(2) Az oltóssavó hiányának bizonyítására a 213/2001/EK rendelet XIX. mellékletében meghatározott elemzési módszer alkalmazandó.

(3) Az összetett takarmányok keményítőtartalmának meghatározását az e rendelet 17. cikkének (3) bekezdésében említett ellenőrzésekkel kell elvégezni, kiegészítve azokat a 213/2001/EK rendelet XXIII. mellékletében meghatározott elemzési módszer alkalmazásával.

(4) A savanyú írópor víztartalmának meghatározását a 213/2001/EK rendelet XXIV. mellékletében meghatározott elemzési módszer alkalmazásával kell elvégezni."

2. A III., IV., V. és VI. mellékletet el kell hagyni.

22. cikk

Hatályon kívül helyezés

Az 1216/68/EGK, a 3942/92/EGK, a 86/94/EK, a 2721/95/EK, az 1854/96/EK, az 1080/96/EK, az 1081/96/EK, az 1082/96/EK, a 880/98/EK, valamint az 1459/98/EK rendelet hatályát veszti.

A hatályon kívül helyezett rendeletekre való hivatkozásokat az e a rendeletre való hivatkozásoknak kell tekinteni.

23. cikk

Hatálybalépés

Ez a rendelet az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő hetedik napon lép hatályba.

Mindazonáltal a III., IV.4., V., VI. valamint VIII. mellékletekben meghatározott módszereket az e rendelet hatálybalépését követő 18. hónap után kell alkalmazni.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

Kelt Brüsszelben, 2001. január 9-én.

a Bizottság részéről

Franz Fischler

a Bizottság tagja

[1] HL L 160., 1999.6.26., 48. o.

[2] HL L 333., 1999.12.24., 11. o.

[3] HL L 340., 1999.12.31., 3. o.

[4] HL L 76., 2000.3.25., 9. o.

[5] HL L 350., 1997.12.20., 3. o.

[6] HL L 11., 1999.1.16., 14. o.

[7] HL L 298., 1985.11.12., 9. o.

[8] HL L 16., 1999.1.21., 19. o.

[9] HL L 45., 1990.2.21., 8. o.

[10] HL L 325., 1999.12.17., 10. o.

[11] HL L 279., 1990.10.11., 22. o.

[12] HL L 28., 2000. 2.3., 16. o.

[13] HL L 256., 1987.9.7., 1. o.

--------------------------------------------------

I. MELLÉKLET

(2. cikk)

REFERENCIA-MÓDSZEREK FELSOROLÁSA

Tárgymutató

Min. = minimum,

Max. = maximum,

Melléklet = az idézett rendelet melléklete,

SNF = zsírmentes szárazanyag,

FFA = szabad zsírsav,

PV = peroxidérték,

A = külső,

F = íz, zamat,

C = állomány,

TBC = összes csíraszám,

Therm = termofil csíraszám,

MS = tagállam,

IDF = Nemzetközi Tejipari Szövetség (International Dairy Federation),

ISO = Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (International Standardization Organisation),

IUPAC = Elméleti és Alkalmazott Kémia Nemzetközi Uniója (International Union of Pure and Applied Chemistry),

ADPI = Amerikai Tejtermék Intézet (American Dairy Products Institute),

SCM = cukrozott sűrített tej,

EMC = sűrített tej vagy tejszín,

MSNF = zsírmentes tejszárazanyag

1. megjegyzés : A 6B:1989 IDF-szabvány szerinti tejzsírizolálás (fény elleni védelem).

2. megjegyzés : Nincs még elfogadott referencia-módszer.

3. megjegyzés : A 122C: 1996 IDF-szabvány, illetve a 73A: 1985 IDF-szabvány szerinti mintaelőkészítés.

4. megjegyzés : inkubálás 48 órán keresztül 55 °C-os hőmérsékleten, ügyelni kell rá, hogy a táptalaj ne száradjon ki.

5. megjegyzés : % SNF = % szárazanyag - % zsír.

6. megjegyzés : A vajnak meg kell felelnie a 2771/1999/EK bizottsági rendelet V. mellékletében említett, a termelő államban érvényes nemzeti minőségi osztálynak.

7. megjegyzés : a 84/8/EGK bizottsági irányelv.

8. megjegyzés : az 1758/94/EK bizottsági rendelet (HL L 183., 1994.7.19., 14. o.).

9. megjegyzés : a 78/633/EGK bizottsági irányelv.

A. RÉSZ

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

SNF | 2 %-ig | X. melléklet | |

FFA (max.) | 1,2 mmól/100 g zsír | 6B:1989 IDF-szabvány | |

PV (max.) | 0,3 meq. oxigén/1000 g zsír | 74A:1991 IDF-szabvány (angol változat) | 1. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 1 g-ból nem mutatható ki | XVII. melléklet | 3. megjegyzés |

Nem tej eredetű zsír | Trigliceridanalízissel nem mutatható ki | XXVI. melléklet | |

Szterin jelölőanyagok | Nem mutatható ki | XIV. melléklet | |

Egyéb jelölőanyagok: | | | |

-vanillin | Nem mutatható ki | XII. melléklet | |

-karotinsav etil-észtere | Nem mutatható ki | XIII. melléklet | |

-önantsav trigliceridje | Nem mutatható ki | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Érzékszervi jellemzők | A, G és C esetében 5-ből legalább 4 pont | VII. melléklet | |

Vízeloszlás | legalább 4 pont | 112A:1989 IDF-szabvány | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Só | 2 %-ig | 12B:1988 IDF-szabvány | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Jelölőanyagok: | | | |

-szterinek | | XIV. melléklet | |

-vanillin | | XII. melléklet | |

-karotinsav etil-észtere | | XIII. melléklet | |

-önantsav trigliceridje | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Só | 2 %-ig | 12B:1988 IDF-szabvány | |

Jelölőanyagok | | | |

- szterinek | | XIV. melléklet | |

- vanillin | | XII. melléklet | |

- karotinsav etil-észtere | | XIII. melléklet | |

- önantsav trigliceridje | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Nedvességtartalom és MSNF | 0,2 %-ig | 23A:1988 IDF-szabvány (nedvesség) 24:1964 IDF-szabvány (MSNF) | |

FFA | 0,35 %-ig (óleinsav) | 6B:1989 IDF-szabvány | |

PV (max.) | 0,5 meq. oxigén/1000 g zsír | 74A:1991 IDF-szabvány (angol változat) | 1. megjegyzés |

Nem tejzsír | nincs | XXV. melléklet | |

Íz | tiszta | | |

Szag | idegen szagoktól mentes | | |

Egyéb | Neutralizálószerektől, antioxidánsoktól és tartósítószerektől mentes | | |

Jelölőanyagok: | | | |

-szterinek | | XIV. melléklet | |

-vanillin | | XII. melléklet | |

-karotinsav etil-észtere | | XIII. melléklet | |

-önantsav trigliceridje | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Jelölőanyagok: | | | |

-szterinek | | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

-vanillin | | XII. melléklet | |

-karotinsav etil-észtere | | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

-önantsav trigliceridje | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

SNF | 2 %-ig | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

Jelölőanyagok: | | | |

-sztigmaszterin (95%) | 15 g 100 kg vajkoncentrátumban | XIV. melléklet | |

-sztigmaszterin (85%) | 17 g 100 kg vajkoncentrátumban | XIV. melléklet | |

-önantsav trigliceridje | 1,1 kg 100 kg vajkoncentrátumban | IUPAC 2.301 sub 5 | |

-vajsav és sztigmaszterin etil-észtere | Lásd a melléklet 1. c) pontját | XIV. melléklet | 2. megjegyzés |

-lecitin (E 322) | 0,5 %-ig | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

NaCl | 0,75 %-ig | 12B:1988 IDF-szabvány | |

FFA | 0,35 %-ig (óleinsav) | 6B:1989 IDF-szabvány | |

PV (max.) | 0,5 meq. oxigén/1000 g zsír | 74A:1991 IDF-szabvány (angol változat) | 1. megjegyzés |

Íz | tiszta | | |

Szag | idegen szagoktól mentes | | |

Egyéb | neutralizálószerektől, antioxidánsoktól és tartósítószerektől mentes | | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Víz | 16 %-ig | IX. melléklet | |

Só | 2 %-ig | 12B:1988 IDF-szabvány | |

Zsír | 1,75 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány | |

Szabad sav | 0,30 %-ig (tejsav) | 91:1979 IDF-szabvány | |

Zsír | 1,00 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány | |

Hamu | min. 7,50 % | 90:1979 IDF-szabvány | |

Tejfehérje | min. 88,00 % | 92:1979 IDF-szabvány | |

Zsír és hamu | 6,00 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány 89:1979 IDF-szabvány vagy 90:1979 IDF-szabvány | |

Zsír | 1,50 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány | |

Szabad sav | 0,20 %-ig (tejsav) | 91:1979 IDF-szabvány | |

TBC (max.) | 30000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 0,1 g mintában negatív | XVI. melléklet | 3. megjegyzés |

Term. (max.) | 5000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. és 4. megjegyzés |

Zsír | 1,00 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány | |

Hamu | min. 7,50 % | 90:1979 IDF-szabvány | |

TBC (max.) | 30000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 0,1 g mintában negatív | XVI. melléklet | 3. megjegyzés |

Term. (max.) | 5000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. és 4. megjegyzés |

Tejfehérje | min. 88,00 % | 92:1979 IDF-szabvány | |

Zsír és hamu | 6,00 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány 89:1979 vagy 90:1979 IDF-szabvány | |

TBC (max.) | 30000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 0,1 g mintában negatív | XVI. melléklet | 3. megjegyzés |

Term. (max.) | 5000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. és 4. megjegyzés |

Tejfehérje | min. 85,00 % | 92:1979 IDF-szabvány | |

Zsír | 1,50 %-ig | 127A:1988 IDF-szabvány | |

Tejcukor | 1,00 %-ig | 106:1982 IDF-szabvány | |

Hamu | 6,50 %-ig | 89:1979 vagy 90:1979 IDF-szabvány | |

TBC (max.) | 30000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 0,1 g mintában negatív | XVI. melléklet | 3. megjegyzés |

Term. (max.) | 5000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. és 4. megjegyzés |

Fehérje | zsírmentes szárazanyag-tartalom min. 31,4 %-a | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Víz (SMP) | 5 %-ig | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Zsírok (SMP) | 11%-ig | 9C:1987 IDF-szabvány | |

Oltóssavó (SMP) | nincs | XIX. melléklet | 7. megjegyzés |

Keményítő (SMP) | nincs | XXIII. melléklet | |

Víz (keverékben) | zsírmentes szárazanyag-tartalom 5 %-áig | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Zsírok (keverékben) | - | a Bizottság 84/4/EGK irányelve (HL L 15., 1984.1.18., 28. o.) | |

Oltóssavó (keverék) | nincs | XIX. melléklet | |

Végtermék SMP tartalma | min. 50 % | XXII. melléklet | 7. megjegyzés |

Zsírok (végtermék) | min. 2,5 % vagy 5 % | a Bizottság 84/4/EGK irányelve | 8. megjegyzés |

Keményítő (végtermék) | min. 2 % | XXIII. melléklet | 9. megjegyzés |

Réz (végtermék) | 25 ppm | a Bizottság 78/633/EGK irányelve (HL L 206. szám, 1987.7.26., 43. o.) | |

Fehérje | zsírmentes szárazanyag-tartalom min. 31,4 %-a | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Víz | 3,5 %-ig | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Savasság (N/10 NaOH) | 19,5 ml-ig | 86:1981 IDF-szabvány | |

Laktátok | 150 mg/100 g-ig | 69B:1987 IDF-szabvány | |

Foszfát | negatív | 3356:1975 ISO szabvány | |

Oldhatóság | 0,5 ml-ig 24 °C-on | 129A:1988 IDF-szabvány | |

Égett szemcsék | min. B korong (15,0 mg) | ADPI:1990 | |

TBC | 40000 l/g | 100B:1991 IDF-szabvány | 3. megjegyzés |

Kólibaktériumok | 0,1 g-ban negatív | XVI. melléklet | 3. megjegyzés |

Író | negatív | XX. melléklet | |

Oltóssavó | negatív | XVIII. melléklet | |

Savanyú savó | negatív | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

Mikrobaölő szerek | | XXI. melléklet | |

B. RÉSZ

A B. részben felsorolt referencia-módszereket olyan termékek elemzésére lehet alkalmazni, amelyekre az 1. oszlopban említett rendeletek bármelyike vonatkozik.

2658/87/EGK rendelet (HL L 256., 1987.9.7., 1. o.), 2414/98/EK rendelet (HL L 299., 1998.11.10., 7. o.), 1374/98/EK rendelet (HL L 185., 1998.6.30., 21. o.), 2508/97/EK rendelet (HL L 345., 1997.12.16., 31. o.), 174/1999/EK rendelet (HL L 20., 1999.1.27., 8. o.) | Tej és tejszín nem sűrítve, cukor vagy más édesítőanyag hozzáadása nélkül | 0401 | Zsír (≤ 6 %) | A határértékek az adott termék KN-kódjában megadottak, vonatkozó esetben, amennyiben alkalmazható, a 3846/87/EGK bizottsági rendeletben (HL L 366., 1987.12.24., 1. o.) az export nómenklatúra 9. részében vagy az 1374/98/EK rendeletben (HL L 185., 1998.6.30., 21. o.) pontosítva | 1D:1996 IDF-szabvány | |

Zsír (> 6 %) | 16C:1987 IDF-szabvány | |

Zsír (szilárd forma) | 9C:1987 IDF-szabvány | |

Fehérje | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Szacharóz (normál tartalommal) | 35A:1992 IDF-szabvány | |

Szacharóz (alacsony tartalommal) | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

Szárazanyag (SCM) | 15B:1991 IDF-szabvány | |

Szárazanyag (EMC) | 21B:1987 IDF-szabvány | |

Víz (tej és tejszínpor) | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Író, erjesztett vagy savanyított tej és tejszín, sűrítve vagy nem sűrítve, cukrozva vagy más édesítőanyag hozzáadásával | 0403 | Zsír | 1D:1996, 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987, 126A:1988 IDF-szabványok | |

Fehérje | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Szacharóz (normál tartalommal) | 35A:1992 IDF-szabvány | |

Szacharóz (alacsony tartalommal) | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

Víz (savanyú írópor) | XXIV. melléklet | |

Víz (édes írópor) | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Szárazanyag (egyéb termékek) | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | |

Savó, sűrítve, cukrozva vagy más édesítőanyag hozzáadásával is; természetes tejalkotórészeket tartalmazó készítmény | 0404 | Zsír | 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987 IDF-szabványok | |

Fehérje | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Szacharóz (normál tartalommal) | 35A:1992 IDF-szabvány | |

Szacharóz (alacsony tartalommal) | Az illetékes hatóság által jóváhagyott módszerek | 2. megjegyzés |

040490 | Fehérje | 20B:1993 IDF-szabvány | |

Víz | 26A:1993 IDF-szabvány | |

Szárazanyag | 15B:1991 IDF-szabvány | |

(sűrített termékek) | 21B:1987 IDF-szabvány | |

Víz | IX. melléklet | |

Vaj | SNF | X. melléklet | |

NaCl | 12B:1998 IDF-szabvány | |

Vajolaj | Zsír (ha > 99 %) | 24:1964 IDF-szabvány | |

Víz (ha a zsír < 99 %) | 23A:1988 IDF-szabvány | |

Szárazanyag | 4A:1982 IDF-szabvány | |

Szárazanyag (Ricotta) | 58:1970 IDF-szabvány | |

NaCl | 88A:1988 IDF-szabvány | |

Tejcukor | 79B:1991 IDF-szabvány | |

--------------------------------------------------

II. MELLÉKLET

(3. cikk)

AZ ÖSSZETÉTELRE ÉS MINŐSÉGRE VONATKOZÓ KÖVETELMÉNYEKET TARTALMAZÓ RENDELETEKBEN ELŐÍRT HATÁRÉRTÉKEKHEZ KÖZEL ESŐ, RUTINMÓDSZEREKKEL KAPOTT EREDMÉNYEK ELLENŐRZÉSE

Amennyiben m0 valamely rendeletben meghatározott, összetételre vagy minőségre vonatkozó követelmény határértéke, az (L) döntési határérték

L = m

ha RRout/RRef ≤ 1

RRout : A rutinmódszer reprodukálhatósági határértéke

RRef : A referencia-módszer reprodukálhatósági határértéke

Amennyiben m0 egy felső határérték, és RRout/RRef > 1, ez a döntési határérték a következő képlet alkalmazásával adható meg:

L = m

· CrD

Amennyiben ugyanezen feltételek mellett m0 egy alsó határérték, a döntési határértéket a következő képlet alkalmazásával kapjuk meg:

L = m

· CrD

ahol CrD95 a referencia-módszer kritikus eltérése (lásd a IV. mellékletet).

Ahol az m0 egy felső határérték, a rutinmódszerrel kapott, döntési határérték feletti végeredményt a referencia-módszerrel kapott végeredménnyel kell behelyettesíteni. Ennek a végeredménynek legalább akkora számú elemzésen vagy mintán kell alapulnia, mint a rutinmódszerrel nyert végeredménynek.

Ahol az m0 egy alsó határérték, ugyanezt az eljárást kell követni olyan esetben, ahol a rutinmódszerrel kapott végeredmény a döntési határérték alatt van.

Megjegyzés:

A fent meghatározott eljárás akkor követhető, ha nincs kimutatható mátrixhatás.

A mátrixhatást a következő módon lehet kimutatni: a kalibrációhoz alkalmazott valamennyi mintában meghatározzuk a referencia-módszerrel és a rutinmódszerrel kapott eredmények közötti eltérést (wi).

A szórás kiszámolásához a következő képletet használjuk:

s =

∑ w

i2/2m

m : A kalibráláshoz használt minták száma, amelyet összehasonlítunk a referencia-módszer és a rutinmódszer ismételhetőségi szórásának számtani középértékével:

+ s

rrout2/2

A mátrixhatás nem zárható ki akkor, ha

+++++ TIFF +++++

ahol:

f = m (f: szabadságfokok száma)

α = hibavalószínűség; α = 0,05.

Ebben az esetben további vizsgálatra van szükség, mielőtt a döntési határértéket rögzíteni lehetne.

--------------------------------------------------

III. MELLÉKLET

(4. és 5. cikk)

a) Eljárás egy elfogadott reprodukálhatósági határérték teljesülésének eldöntésére (vegyi elemzés)

A reprodukálhatósági határérték teljesülését úgy ellenőrizzük, hogy a laboratóriumi eredményeket egy tapasztalt laboratórium által ugyanolyan mintából nyert eredményekkel vetjük egybe [1]. Mindkét laboratóriumban kettős meghatározást kell végezni, és az eredményeket a következő képlettel kell értékelni:

CrD

ahol:

CrD

95 : a kritikus eltérés (P = 0,95)

-1 : az 1. számú laboratóriumban nyert két eredmény számtani középértéke

-2 : a 2. számú laboratóriumban nyert két eredmény számtani középértéke

R : reprodukálhatósági határérték, interpolációval kell meghatározni

r : ismételhetőségi határérték: ha a pontosság szintenként változik.

Amennyiben a kritikus eltérést meghaladó eredmény jön ki, két hónapon belül újabb elemzést kell végezni. Ha a második elemzés eredményei nem felelnek meg a reprodukálhatósági határértéknek, az illetékes hatóságok megteszik a szükséges intézkedéseket.

b) Eljárás ideiglenes reprodukálhatósági határértékek meghatározásához (vegyi elemzés)

Ideiglenes reprodukálhatósági határértéket kapunk (Rprov), ha a következő egyenletet alkalmazzuk:

r22

ahol:

-1 : Az 1. számú laboratóriumban nyert két eredmény számtani középértéke

-2 : A 2. számú laboratóriumban nyert két eredmény számtani középértéke

r : Ismételhetőségi határérték vagy ideiglenes ismételhetőségi határérték.

Megjegyzések:

1. Az Rprov kritikus eltérések kiszámítására is használható (lásd VI. melléklet).

2. Az Rprov-t 2r-nél rögzítjük, ha a számított Rprov-érték 2r-nél kisebb.

3. RSDR c [2] által megjósolt R-érték kétszerese, akkor az Rprov elfogadhatatlanul magas, és nem alkalmazható a kritikus eltérés kiszámítására.

4. Az Rprov-értéket két laboratóriumban kapott eredmény alapján évente legalább egyszer meg kell határozni (lásd a IV. mellékletet).

5. Az Rprov középértékét a kritikus eltérések számításához kell felhasználni. A 2. és 3. pontban megadott szabályok érvényesek az Rprov középértékére is.

A reprodukálhatósági határértéket (R-érték) a számított RSDR-értékből a következő módon kapjuk meg:

R = 0,0283

RSD

- : a kapott eredmények számtani középértéke

Néhány számított RSDR-érték (példák)

Koncentráció | RSDR (%) |

1 g/100 g | 4 |

0,01 g/100 g | 8 |

1 mg/1000 g | 16 |

Az ismételhetőségi határérték az elemzésnek alávetett anyag 1 g/100 g koncentrációja esetén tehát:

R = 0.0283 * 1 * 4 = 0,11 g/100 g.

[1] Tapasztalt laboratóriumnak azt tekinthetjük általában, amely sikeresen vett részt vagy a vizsgálati módszer érvényesítésében, vagy egy szakmai jártassági vizsgálatban.

[2] koncentráció tizedesjeggyel kifejezve (például: 10 g/100 g = 0,1).Hivatkozás:Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.J. Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).

--------------------------------------------------

IV. MELLÉKLET

(4. cikk)

A KAPOTT ELEMZÉSI EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉRVÉNYESÍTETT MÓDSZEREK HASZNÁLATÁVAL

Amennyiben az elemzési eredmény azt mutatja, hogy valamely határérték túllépésére került sor, két vagy több eredmény számtani középértékét számítjuk ki. A következő eljárást kell követni:

1. Olyan esetekben, ahol az elemzési eredmény egyetlen eredményt képvisel, még egy elemzést kell elvégezni az ismételhetőségi feltételek figyelembevételével. Amennyiben nem lehetséges két elemzést az ismételhetőségi feltételek figyelembevételével elvégezni, ellenelemzést kell elvégezni az ismételhetőségi feltételek mellett, továbbá annak eredményeit kell alkalmazni a kritikus eltérési feltétel teljesülésének megítélésére.

2. Az ismételhetőségi feltételek mellett kapott eredmények számtani középértéke és a határérték közötti különbség abszolút értékét meg kell határozni. Amennyiben a különbség abszolút értéke nagyobb, mint a kritikus eltérés, akkor ez azt jelenti, hogy az elemzett minta nem elégíti ki a követelményeket.

A kritikus eltérést a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:

CrD

- m

ahol:

- : a kapott eredmények számtani középértéke

m0 : a határérték

n : az elemzések/minták száma.

Amennyiben a pontosság szintenként változik, az r és R meghatározásához interpolációra lehet szükség.

Rendes esetben egy minta rögzített végeredményének azt kell mutatnia, hogy a minta megfelel a határértéknek.

Ennélfogva, végeredmények

- az m

és m

+ CrD

tartományban, ha a határérték a maximum, és

- az m

és m

+ CrD

tartományban, ha a határérték a minimum

csak kivételes esetekben fordulhatnak elő.

A fent említett tartományba eső végeredmények csak akkor tekinthetők elfogadhatónak, ha a szállítmányonként elemzett öt mintából egynél többször nem fordulnak elő. Amennyiben egy szállítmányból ötnél kevesebb mintát elemeznek, egy olyan eredmény, amely az említett tartományba esik, még elfogadható. Azonban ha valamely termelő ismételten ajánl fel szállítmányokat, ragaszkodni kell ahhoz a szabályhoz, hogy minden öt elemzett mintára csak egyetlen, a fenti tartományba eső eredményt kaphatunk.

3. Amennyiben az x végeredményt az x = y1 ± y2 forma képletének alkalmazásával számítjuk ki (példa: víz + a vajnak nem élelmiszer eredetű zsírmentes szárazanyag-tartalma a zsírtartalom kiszámításához), ahol y1 és y2 egyetlen elemzési típus végeredményei, akkor az x végeredményhez tartozó rx és Rx általános ismételhetőségi és reprodukálhatósági határértékek a következők szerint számolhatók ki:

2r12+ r22

2R12+ R22

ahol r1 és r2 az y1 és y2 értékekhez tartozó ismételhetőségi határértékek, míg R1 és R2 az ugyanezekhez tartozó reprodukálhatósági határértékek.

Az x értéket az 1. és 2. pontokban meghatározott szabályok figyelembevételével összehasonlítjuk az m0 határértékkel. A kritikus eltérést a következő összefüggés adja meg:

CrD

x - m

ahol x a kapott x1 értékek számtani középértéke.

4. Amennyiben a végeredményt a következő formájú képlettel számítjuk ki:

x =

(példa: sajt szárazanyag-tartalmában található zsír)

ahol y1 és y2 egyetlen elemzési típus végeredményei, akkor az rx és Rx általános ismételhetőségi és reprodukálhatósági határértékek a következők szerint számolhatók ki:

= μ

x2r*12+ r*22

= μ

x2R*12+ R*22

= μ

| μ

μ1 : határérték vagy célérték y1-hez (példa: zsír)

μ2 : határérték vagy célérték y2-höz (példa: szárazanyag)

≤ 0,15

ahol:

r1 : y1 ismételhetőségi értéke

r2 : y2 ismételhetőségi értéke

≤ 0,15

ahol:

R1 : y1 reprodukálhatósági értéke

R2 : y2 reprodukálhatósági értéke.

Az rx és Rx számítására alkalmazott eljárások csak akkor alkalmazhatók, ha a viszonylagos ismételhetőségi és reprodukálhatósági határértékek (r*1; r* 2; R* 1; R* 2) 0,15-nél kisebbek, vagy azzal egyenlők.

Az x értéket az 1. és 2. pontokban meghatározott szabályok figyelembevételével összehasonlítjuk a μx határértékkel. A kritikus eltérést a következő összefüggés adja meg:

CrD

- μ

ahol

a kronológiai sorrendben kapott x értékek számtani középértéke [1].

[1] Megjegyzés:Ha például a kapott eredmények y11, y12, y21 és y22, az y11/y21 és y12/y22 számtani középértékét kell kiszámolni.

--------------------------------------------------

V. MELLÉKLET

BELSŐ ELLENŐRZÉS

(5. cikk)

a) Belső minőség-ellenőrzési (IQC) eljárás (vegyi elemzés)

A kontrollanyag meghatározása

A belső minőség-ellenőrzésre használt anyagon ugyanazokat - vagy legalábbis részben ugyanazokat - a műveleteket végezzük el, mint a vizsgált anyagon.

A kontrollanyag lehet:

- bizonylattal ellátott referenciaanyag,

- házon belüli referenciaanyag,

- laboratóriumok közötti vizsgálatokkal érvényesített anyag,

- dúsított anyag.

A belső minőség-ellenőrzés kialakításának folyamata

A laboratóriumnak az IUPAC "A belső minőség-ellenőrzés összehangolt irányelvei analitikai laboratóriumok számára" című dokumentumában foglaltakat követve kell az IQC-t bevezetniük [1].

Az IQC magában foglalja az ellenőrző anyagoknak (kontrollanyag) a vizsgálati minta elemzési sorozatába, illetve ismétlő elemzésébe történő bevonását. A kontrollanyagoknak vegyi összetételüket tekintve a vizsgálati mintához kell hasonlítaniuk, és a kérdéses időszakra vonatkozóan megfelelő stabilitással kell rendelkezniük. Bizonyítani kell, hogy elemzési célból azonos adagokra oszthatók fel, és a vizsgált tartományban az elemzett mintához hasonlóan megfelelő koncentrációban fordulnak elő.

A kontrollanyagot a hosszú távú hibák mérése érdekében minden analitikai tételsorozatba legalább egyszer be kell illeszteni, és a kapott értéket egy kontrollgörbén fel kell rajzolni. Ezen túlmenően, a laboratóriumnak időről időre demonstrálnia kell, hogy teljesíti a sorozaton belül az ismételhetőségi feltételeket. Ez elérhető a kontroll- és/vagy a vizsgálati anyagok ellenelemzése révén. Ezeknek az elemzéseknek az eredményeit össze kell hasonlítani a publikált ismételhetőségi határértékekkel, valamint a házon belüli pontosság meglévő adataival.

Ahol kontrollanyagok használatára kerül sor, a kontrollanyagnak sorozatok közötti elemzésére kapott értékeket a megfelelő kontrollhatárértékekkel együtt egy Shewhart-grafikonon kell ábrázolni (ISO 8258 [1991]). Az intézkedési határt a következőképpen kell megállapítani:

x ± 3s

ahol st a teljes szórás,

a figyelmeztetési szint pedig

x ± 2s

A teljes szórás:

2sb2+ sw2/n

amelyben:

sb : a sorozatok közötti szórás

sw : a sorozaton belüli szórás

n : a meghatározások száma.

Olyan esetekben, ahol kontrollanyagot nem alkalmazunk (például a stabilitás hiánya miatt), a vizsgálati anyagok közül legalább egyet kettős elemzésnek kell alávetni minden sorozatban.

Az egy sorozaton belül végzett kettős elemzésekből eredő abszolút különbséget (lásd a III. mellékletet) fel kell rajzolni. A középvonal 1,128 sw, az alsó határérték 0, a felső határérték (az intézkedési határ) 3,686 sw, ahol sw a sorozaton belüli szórás.

A kontrolleljárásnak kis és nagy anyagkoncentrációkat is kell tartalmaznia olyan esetben, amikor a koncentrációs tartomány széles.

Ha a vizsgálati anyagok az elemzett minta tág koncentrációs tartományait fedik le, a laboratóriumnak meg kell állapítania a pontosság és a koncentráció közötti összefüggést. Ha a pontosság arányos a koncentráció szintjével, az ezt követő kontrollokat már lehet relatív pontosságra alapozni (vagyis az abszolút különbségre a középérték százalékában kifejezve).

Az analitikai rendszer nem ellenőrizhető állapotát jelzi, ha a következők közül bármelyik előfordul:

A. az aktuális ábrázolt érték az intézkedési határon kívül esik;

B. az aktuális érték és az azt megelőző érték a figyelmeztetési határon túlra, de még az intézkedési határon innen esik;

C. ahol kontrollanyagokat használunk, kilenc egymást követő érték a középérték vonalának ugyanazon oldalára esik.

A laboratórium egy ilyen ellenőrizhetetlen állapotra a következőképpen válaszolhat:

A. leállítja a folyamatban lévő diagnosztikai vizsgálatokat, és helyreállító intézkedéseket tesz, és

B. elveti az adott sorozat eredményeit, és újra elemzi a vizsgálati anyagokat.

b) A házon belüli kontrollanyagok kiválasztásának és a házon belüli pontossági határértékek meghatározásának eljárása (vegyi elemzés)

A laboratóriumon belüli pontosságra vonatkozó adatokat nyerhetünk a kontrollanyagok ismételt elemzésével és/vagy a vizsgálati minták ismételt elemzésével.

A laboratóriumoknak a következőkben meghatározott eljárást kell használniuk a sorozaton belüli és sorozatok közötti eltérésekre vonatkozó pontossági paraméterek megállapítására és abból a kontrollgrafikon megszerkesztésére. A laboratóriumok ehhez alternatív megoldásokat is igénybe vehetnek, feltéve, hogy hitelt érdemlően tudják bizonyítani, hogy megbízható pontossági adatokat kaptak.

1. A kontrollanyagok kiválasztása

Amennyiben a laboratórium számára megfelel a kontrollanyag használata, először adatgyűjtésre van szükség a határértékek beállításához. Amennyiben csak lehetséges, bizonylattal ellátott referenciaanyag (CRM) használatára kell törekedni. A kontrollnak jelölt anyagokat az ismételhetőségi feltételek betartása mellett egy olyan sorozaton belül kell elemezni, amely ismétléssel és véletlenszerű elrendezéssel rendelkező, megfelelő CRM-et tartalmaz. Amennyiben ez a megközelítés nem lehetséges, a laboratóriumoknak törekedniük kell szakmai alkalmassági vizsgálatokon való részvételre és konszenzusos átlagok (hozzárendelt értékek) kialakítására, amely olyan konvencionális valós középértéknek tekinthető, amelyhez egy értelemszerű bizonytalansági faktor rendelhető. A többi eljáráshoz olyanok tartoznak, mint a valós értékek kialakítása összeállítással, illetve a csúcsértékkel rendelkező kontrollanyagok használata.

Ezen túlmenően, amennyiben a laboratórium rendszeresen végez ilyen típusú elemzéseket, és már van kialakított statisztikai kontrollja, minden új kontrollanyagot (amelyre például azért van szükség, mert kifogyott a készlet) a meglévő anyagokkal végzett, kontrollált elemzésekre tekintettel kell nyerni.

2. Határértékek hozzárendelése

A kontrollanyag kiválasztása után, a laboratóriumnak ezt kell használnia a sorozaton belüli és a sorozatok közötti pontossági adatokat megállapítására.

A sorozaton belüli pontosság megállapításának minimális követelményeként, a kontrollanyagot kettőzve kell elemezni 12 alkalommal. A kettős elemzést az ismételhetőségi feltételek mellett kell végezni, vagyis ugyanannak a laboránsnak, ugyanazokkal a reagensekkel stb. A kontrollanyag kettős elemzését egy sorozaton belül véletlenszerű elrendezésben kell végezni. Minden kettős elemzést külön napon olyan időszak alatt kell végezni, hogy az tükrözze a sorozatok közötti reális különbségeket, figyelembe véve a rendes eltérési lehetőségeket, így például a reagenseket, a műszerek újrakalibrálását és, amennyiben szükséges, az elemzést végző eltérő személyét.

Megjegyzés:

Az olyan adatok használata, amelyek nem tükrözik teljes mértékben a sorozatok közötti eltéréseket, az elemzések szükségtelen ismétléséhez vezethet, mert túlságosan szűk határértékeket adtunk meg. Ezzel szemben egy olyan laboratórium, amely túlságosan pontatlan pontossági adatokat ad meg, esetleg nem tud megfelelni a referencia-módszerekben előírt határértékeknek, várhatóan gyenge teljesítményt fog felmutatni a társlaboratóriumokkal való összehasonlításban, és nem tud olyan adatokat produkálni, amelyek megfelelnek a szándékolt cél elérésének.

2.1. Sorozaton belüli pontosság meghatározása

2.1.1. Sorozaton belüli pontosság olyan esetben, ahol van rendelkezésre álló kontrollanyag

A páros adatokat (legalább 12 párt) először a Cochran-féle maximális varianciavizsgálatnak kell alávetni. Ez a legnagyobb kettős tartományok négyzetre emelt értékét veti egybe a tartományok négyzetének összegével.

c =

max

∑

ahol:

di = a párok közötti különbség.

A Cochran-féle C értéket összehasonlítjuk a táblázatos értékekkel (ISO 5725 [1994]). Ha valamely értéket túlságosan kiugrónak vagy a szokásostól jelentősen eltérőnek ítélünk, az eredmény okát ki kell nyomozni, és meg kell magyarázni - például technikai hiba, számítási hiba, a vizsgálat elvégzésébe csúszott hiba vagy rossz minta elemzése. Ha a technikai hiba magyarázata alapján nem lehetséges a gyanús eredmény helyettesítése, akkor azt tényleges szórásként ki kell zárni. Amennyiben marad olyan kiugró vagy szóró érték, amelyre nincs magyarázat, a kiugró értékeket valósnak ítéljük, és megtartjuk, míg a statisztikai szórásból eredő értékeket elvetjük. A laboratóriumnak ilyenkor igyekeznie kell helyettesítő értékeket nyernie.

Amikor a laboratórium elfogadta, hogy az adatok mentesek a kiugró értékektől, a sorozaton belüli szórás sw-értékét a következők szerint állapíthatjuk meg: a p kettős adatok minden xi1, xi2 adatpárjára kiszámítjuk és összeadjuk a kettős adatok összegét,

= x

+ x

valamint a kettős adatok különbségét:

= x

- x

a következőképpen:

A = ∑

B = ∑

C = ∑

A sorozaton belüli szórásra vonatkozó becslés a következő lesz:

2B2p

A házon belüli pontossági határérték 2,8. sw.

Ha referencia-módszert használunk, a házon belüli pontossági határértéket össze kell hasonlítani a nyilvánosságra hozott ismételhetőségi határértékkel. A laboratóriumnak be kell tartania a referencia-módszerre vonatkozó követelményeket. Amennyiben a követelményeket nem sikerül teljesíteni, annak okát ki kell vizsgálni.

Az így megállapított határértékeket ideiglenesnek és felülvizsgálhatónak kell tekinteni.

2.1.2. Sorozaton belüli pontosság olyan esetekben, ahol nem áll rendelkezésre kontrollanyag

A laboratórium úgy is dönthet, hogy a reprezentatív vizsgálati mintákat kettős elemzésnek veti alá, és így határozza meg a sorozaton belüli pontosságot (legalább 12 kettős elemzést kell elvégezni). Olyan esetekben, ahol kontrollanyag használata nem lehetséges, például azért, mert instabilitás áll fenn, a kettős adatokat ilyen módszerrel kell összegyűjteni.

Megjegyzés:

Feltételezhető, hogy az elemzések csak az értékek igen kis tartományát fedik le, és ezért ugyanazt az egyetlen értéket lehet alkalmazni minden mintára. Olyan esetekben, ahol az eredmények nagyobb tartományt ölelnek fel, például egy teljes nagyságrendet, a pontosság pedig a szintektől függ, a laboratóriumoknak meg kell vizsgálnia a relatív normál szórás alkalmazásának lehetőségeit.

Az adatokat alá kell vetni a 2.1.1. pont szerinti Cochran-féle vizsgálatnak. Ha a laboratórium meggyőződött róla, hogy az adatok között nincs kiugró szórás, meg lehet határozni a sorozaton belüli szórást és a házon belüli pontosság határértékét a 2.1.1. pontban leírtak szerint.

Az sw-sorozaton belüli szórás felhasználható kontrollgrafikonok készítésére is (lásd a II. mellékletet). Az így megállapított határértékeket ideiglenesnek és felülvizsgálhatónak kell tekinteni.

2.2. Sorozatok közötti pontosság meghatározása

Számítsuk ki az egyes értékpárok átlagértékeit (s1/2), és ezeket vessük alá a Grubbs-tesztnek (ISO 5725 [1994]). A kiugró és jelentősen eltérő értékek elfogadásának, illetve elvetésének feltételeit a 2.1.1. pontban foglaltak tartalmazzák. A laboratóriumnak ilyenkor igyekeznie kell helyettesítő értékeket nyernie az elvetett értékek helyett. Ha a laboratórium meggyőződött róla, hogy az adatok között nincs kiugró szórás, meghatározza a sorozatok közötti sb-szórást a következők szerint:

C -

Β -

illetve 0 akkor, ha a négyzetgyök alatti kifejezés értéke negatív.

Az st-teljes szórás felhasználható az n meghatározások átlaga kontrollgrafikonjának készítésére is (lásd a II. mellékletet). Az így megállapított határértékeket ideiglenesnek és felülvizsgálhatónak kell tekinteni.

3. A kiindulási határértékek felülvizsgálata

A fentiek szerint megállapított ellenőrzési határértékeket kiindulási becsült értékeknek kell tekinteni.

Annak érdekében, hogy az elfogadható mértékű sorozaton belüli pontosság (2.1.2. pont) alapján meghatározott határértékeket frissítsük, további kettős adatokat kell a vizsgálati mintákból gyűjteni. Az, hogy milyen sűrűn kell a felülvizsgálatot elvégezni, az elemzések gyakoriságán múlik. Iránymutatásként, az adatokat akkor kell átvizsgálni, ha 10 további kettős adatot már kaptunk. Ezután az összes adatot alá kell vetni a Cochran-féle tesztnek, és a határértékeket a kapott új szórás számadatának megfelelően kell újrahatározni. Az ellenőrzési határérték érvényességére vonatkozó ezt követő döntéseket a további adatok fényében kell meghozni.

A sorozatok közötti pontosságra vonatkozó kiinduló adatok felülvizsgálatát szintén az elemzés gyakoriságától kell függővé tenni. Iránymutatásként, amennyiben a kontrollanyag elemzéséből tételenként, egy elemzésgyakorisággal már további tíz adatpont gyűlt össze, a középértékre és a szórásra vonatkozó kiindulási feltételezéseket felülvizsgálat tárgyává kell tenni.

Az összes adaton el kell végezni a kiugró értékeket kimutató Grubbs-féle tesztet. A középértéket és a szórást az új adatok alapján kell újraszámítani.

Ezen túlmenően, ebben a pontban a laboratórium alkalmazhat egy Cusum-grafikont is (BS S700: [1984] és módosítása 5480 [1987]) minden olyan probléma kivizsgálására, amely például a reagensek elöregedéséből ered. Minden egyes eredményt, amely kívül esik a Cusum-féle "V-maszk"-határokon, ki kell vizsgálni.

Az új határértékeken (középérték és szórás) rendszeres ellenőrzést kell végrehajtani a Cusum-technika alkalmazásával. Bármely olyan jelzést, amely a kontrollanyag érvényességét kérdőjelezi meg, alaposan ki kell vizsgálni.

4. A pontossági adatok lejelentése

A laboratóriumok a következő tájékoztatást adják az illetékes nemzeti hatóságoknak:

- az alkalmazott módszer,

- a sorozaton belüli szórás sw és a házon belüli pontossági határérték,

- a folyamatok közötti szórás sb,

- a teljes szórás s1,

- a pontossági adatok megszerzéséhez igénybe vett elemzések száma.

[1] M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

--------------------------------------------------

VI. MELLÉKLET

(6. cikk)

A BÍRÁLÓK ÉRTÉKELÉSE ÉS AZ EREDMÉNYEK MEGBÍZHATÓSÁGA AZ ÉRZÉKSZERVI ELEMZÉSEKNÉL

A következő eljárások alkalmazandók, ha pontozásos módszereket használunk (99C/1997 IDF-szabvány).

a) Az "ismételhetőségi index" meghatározása

Egy 12 hónapos időszakon belül a bíráló személynek legalább tíz mintát kell azonosítatlan mintaként elemeznie. Ez rendszerint több alkalommal történik. Az egyes termékjellemzők eredményeit a következő képlettel értékelhetjük:

∑

ahol:

1 : az ismételhetőségi index

i1 : az xi minta első értékelésére adott pontszám

i2 : az xi minta második értékelésére adott pontszám

n : a minták száma.

Az értékelendő mintáknak tág minőségi határokat kell átfogniuk. A w1 nem lehet 1,5-nél nagyobb (5 fokú skála).

b) "Az eltérési index" meghatározása

Ezt az indexet annak ellenőrzésére használjuk, hogy valamely bíráló ugyanazt a skálát alkalmazza-e a minőség értékelésére, mint egy tapasztalt bírálókból álló csoport. A bíráló által adott pontszámokat összehasonlítjuk a bírálókból álló csoport által adott pontszámokból számított középértékkel.

A következő képlet alkalmazandó az eredmények értékelésére:

= 1 +

∑

-x

-i222n

ahol:

xi1; xi2 : lásd az a) pontot

; x

-i2 : a bírálókból álló csoport által az xi mintára az első, illetve a második értékelés alkalmával adott átlagos pontszám

n : a minták száma (12 havonta legalább tíz).

Az értékelendő mintáknak tág minőségi határokat kell átfogniuk. A D1 nem haladhatja meg az 1,5-ös értéket (5 pontos skála).

A tagállamoknak jelenteniük kell minden nehézséget, amely ennek az eljárásnak az alkalmazása során merül fel.

c) Egy tagállam különböző régióiban, illetve a különböző tagállamokban nyert eredmények közötti különbségek egybevetése

Amennyiben alkalmazható, évente legalább egyszer ellenőrző vizsgálatot kell szervezni a különböző régiókban működő bíráló személyek által nyert eredmények összehasonlítására. Amennyiben jelentős eltérések tapasztalhatók, meg kell tenni a szükséges lépéseket az okok azonosítására és egymással egybevethető eredmények kialakítására.

A tagállamok megszervezhetik a saját bírálóik által kapott eredmények és a szomszédos tagországok bírálói által kapott eredmények összevetésére alkalmas ellenőrző vizsgálatokat. Amennyiben jelentős eltérés tapasztalható, mélyreható nyomozást kell végezni annak érdekében, hogy egymással egybevethető eredmények szülessenek.

A tagállamoknak értesíteniük kell a Bizottságot az ilyen összehasonlító vizsgálatok eredményéről.

--------------------------------------------------

VII. MELLÉKLET

(6. cikk)

VAJ ÉRZÉKSZERVI ÉRTÉKELÉSE

1. Tárgy

A vaj érzékszervi értékelésére vonatkozó ezen eljárás célja az összes tagállamban alkalmazandó egységes módszer kialakítása.

2. Fogalommeghatározások

"Érzékszervi értékelés" (bírálat): egy termék jellemzőinek érzékszervekkel való vizsgálata.

"Bizottság": a kiválasztott bírálók egy csoportja, akik az értékelések során kölcsönös érintkezés és egymás befolyásolása nélkül járnak el.

"Pontozás": a bizottság érzékszervi vizsgálatainak értékelése egy számskála segítségével. Ehhez a hibajegyzéket kell használni.

"Osztályozás": minőségi osztályba sorolás, amelyet a pontozás alapján végeznek.

"Ellenőrző dokumentumok": azok a dokumentumok, amelyeket az egyes jellemzők pontjainak és a termék végső osztályozásának jegyzőkönyvezésére használnak. (Ez a dokumentum használható a kémiai összetétel nyilvántartásba vételére is.)

3. Vizsgálóhelyiség

3.1. Gondoskodni kell arról, hogy a bírálókat a vizsgálóhelyiségben külső tényezők ne befolyásolják.

3.2. A vizsgálóhelyiségnek idegen szagoktól mentesnek és könnyen tisztíthatónak kell lennie. A falak világos színűek legyenek.

3.3. A vizsgálóhelyiség és annak megvilágítása olyan legyen, hogy azok a pontozni kívánt termék jellemzőit ne befolyásolják. A helyiséget megfelelő hőmérséklet-szabályozóval kell ellátni.

4. A bírálók kiválasztása

A bírálóknak ismerniük kell a vajtermékeket, és alkalmasnak kell lenniük az érzékszervi osztályozás elvégzésére. Az alkalmasságot rendszeres időközönként (évente legalább egyszer) az illetékes hatóságnak ellenőrizni kell.

5. A bizottsággal kapcsolatos követelmények

A bizottságban lévő bírálók számának páratlannak kell lennie, minimum három fő szükségeltetik. A bírálók többsége az illetékes hatóság alkalmazottja, vagy olyan felhatalmazott személy, aki nem a tejipar alkalmazottja.

Mielőtt az értékelésre sor kerülne, a következő tényezőket kell figyelembe venni ahhoz, hogy a bírálóktól optimális teljesítményt várhassunk el:

- A bírálók nem szenvedhetnek olyan betegségben, amely teljesítményükre káros hatást gyakorolna. Ilyen esetben az érintett bírálót a zsűriben egy másik személlyel kell helyettesíteni.

- A bírálóknak pontosan kell megjelenniük a bírálat eseményén, és biztosítaniuk kell, hogy elegendő idő álljon rendelkezésükre a bírálat elvégzéséhez.

- A bírálók nem használhatnak erős illatú anyagokat, úgymint parfüm, arcszesz, dezodor stb., valamint kerülniük kell az erősen ízesített (például nagyon fűszeres) ételeket.

- A bírálók nem dohányozhatnak, nem ehetnek, és vízen kívül más folyadékot nem fogyaszthatnak a bírálatot megelőző fél órában.

6. Az egyes jellemzők értékének elbírálása

6.1. Az érzékszervi vizsgálatokat mindig a következő három jellemzőre kell elvégezni: külső, állomány és zamat.

A külső a következő jellemzőket foglalja magában: szín, látható tisztaság, penészfolt-növekedés és vízeloszlás. A víz eloszlását a 112A/1989 IDF-szabvány szerint kell ellenőrizni.

Az állományra vonatkozó értékelés a következő jellemzőket foglalja magában: szilárdság és kenhetőség.

A vaj állományának értékeléséhez fizikai módszereket is lehet alkalmazni. A Bizottság tervbe vette ezeknek a módszereknek a jövőbeni harmonizálását.

A zamatra vonatkozó értékelés a következő jellemzőket foglalja magában: íz és szag.

Az ajánlott hőmérséklettől való jelentős eltérés megakadályozza az állomány és zamat megbízható értékelését. A hőmérsékletnek van a legnagyobb jelentősége.

6.2. Minden egyes jellemzőt külön kell érzékszervi értékelésnek alávetni. A pontozást az 1. táblázat szerint kell végezni.

6.3. Az egységes megítélés elérése érdekében a bírálók számára kívánatos, hogy a bírálat előtt egy vagy több referenciamintán közösen végezzenek pontozást a külső, az állomány és a zamat vonatkozásában.

6.4. Az elfogadhatóság tekintetében a pontozás a következő:

| Maximum | Kívánatos |

Külső | 5 | 4 |

Állomány | 5 | 4 |

Zamat | 5 | 4 |

Ahol a termék nem éri el a kívánt pontszámot, a hiba leírását meg kell adni. Az ellenőrző dokumentumban jegyzőkönyvezni kell az egyes bírálók által az egyes jellemzőkre adott pontokat. A terméket többségi döntés alapján fogadják, illetve utasítják el. Lehetőleg el kell kerülni az olyan pontszámok gyakori előfordulását, ahol az egyes tulajdonságokra adott egyedi pontszámok eltérése nagyobb, mint a szomszédos pontszám (legfeljebb 20 mintánként egyszer). Különben a bizottság vezetőjének ellenőriznie kell a bizottság alkalmasságát.

7. Felügyelet

Rendszerint a bizottság elnöke, aki az illetékes hatóság alkalmazottja, és aki tagja lehet a bizottságnak, felelős az eljárás egészéért. Az ellenőrző dokumentumban jegyzőkönyveznie kell az egyes jellemzőkre adott egyes pontokat, és igazolnia kell, hogy a terméket elfogadták vagy elutasították.

8. Mintavétel és a minta előkészítése

8.1. - Ajánlatos, hogy a minták azonosítása rejtve maradjon az értékelés során az esetleges részrehajlás elkerülése érdekében.

- Ezt a bizottság elnökének kell megszerveznie az értékelés előtt, a bizottság tagjainak jelenléte nélkül.

8.2. Amikor az érzékszervi vizsgálatra hűtőraktárban kerül sor, a mintát vajmintavevővel kell venni. Amennyiben az érzékszervi vizsgálatra nem hűtőraktárban kerül sor, hanem valamely más helyszínen, legalább 500 gramm mintát kell venni.

8.3. A bírálat során a vaj hőmérséklete 10 és 12 °C között legyen. Az ettől való nagy eltéréseket feltétlenül kerülni kell.

9. Hibajegyzék

Lásd a mellékelt 2. táblázatot.

1. táblázat: Vaj pontozása

Külső | Állomány | Zamat és aroma |

5 | | Nagyon jó ideális típus legjobb minőség (egyenletesen száraz) | 5 | | Nagyon jó ideális típus legjobb minőség (jól kenhető) | 5 | | Nagyon jó ideális típus legjobb minőség (teljesen tiszta, finom aroma) |

4 | | Jó [2] | 4 | | Jó [2] | 4 | | Jó [2] |

| | 18 | lágy | | |

3 | | Megfelelő (enyhe hibák) | 3 | | Megfelelő (enyhe hibák) | 3 | | Megfelelő (enyhe hibák) |

1 | Kivált (szabad) víz | 14 | tömör, törékeny, morzsálódó | 21 | tisztátalan |

2 | nem egységes, kettős színű | 15 | pépes, tésztás, zsíros | 22 | idegen íz |

3 | csíkos | 16 | ragadós | 25 | savanyú |

4 | pettyes, márványos | 17 | kemény | 27 | főtt íz, égett íz |

5 | foltos | 18 | lágy | 33 | takarmányíz |

6 | olajkiválás | | | 34 | nyers, keserű |

7 | túlszínezett | | | 35 | túlsózott |

8 | gyenge, nyílt szerkezet | | | | |

2 | | Gyenge (nyilvánvaló hibák) | 2 | | Gyenge (nyilvánvaló hibák) | 2 | | Gyenge (nyilvánvaló hibák) |

1 | Kivált (szabad) víz | 14 | tömör, törékeny, morzsálódó | 21 | tisztátalan |

3 | csíkos | 15 | pépes, tésztás, zsíros | 22 | idegen íz |

4 | pettyes, márványos | 16 | ragadós | 23 | állott |

5 | foltos | 17 | kemény | 25 | savanyú |

6 | olajkiválás | 18 | lágy | 32 | oxidált íz, fémes íz |

10 | idegen anyag | | | 33 | takarmányíz |

11 | penészes | | | 34 | nyers, keserű |

12 | oldatlan só | | | 35 | túlsózott |

| | | | 36 | dohos, bűzös |

| | | | 38 | vegyszerízű |

1 | | Igen gyenge (súlyos hibák) | 1 | | Igen gyenge (súlyos hibák) | 1 | | Igen gyenge (súlyos hibák) |

1 | szabad víz | 14 | tömör, törékeny, morzsálódó | 22 | idegen íz |

3 | csíkos | 15 | pépes, tésztás, zsíros | 24 | sajtos íz, savanyú sajtos íz |

4 | pettyes, márványos | 16 | ragadós | 25 | savanyú |

5 | foltos | 17 | kemény | 26 | élesztős íz |

6 | olajkiválás | 18 | lágy | 28 | penészes íz |

7 | túlszínezett | | | 29 | avas |

9 | szemcsés | | | 30 | olajos, halízű |

10 | idegen anyag | | | 31 | faggyús íz |

11 | penészes | | | 32 | oxidált íz, fémes íz |

12 | oldatlan só | | | 34 | nyers, keserű |

| | | | 36 | dohos, bűzös |

| | | | 37 | malátaízű |

| | | | 38 | vegyszerízű |

2. táblázat: A vaj hibáinak jegyzéke

I. Külső

1. kivált (szabad) víz

2. nem egységes, kétszínű

3. csíkos

4. pettyes, márványos

5. foltos

6. olajkiválás

7. túlszínezett

8. gyenge (nyílt szerkezet)

9. szemcsés

10. idegen anyag

11. penészes

12. oldatlan só

II. Állomány

14. tömör, törékeny, morzsálódó

15. pépes, tésztás, zsíros

16. ragadós

17. kemény

18. lágy

III. Zamat és aroma

20. ízetlen

21. tisztátlan [3]

22. idegen íz

23. állott

24. sajtos, savanyú sajt íz

25. savanyú

26. élesztős

27. a) főtt íz

b) égett íz

28. penészes íz

29. avas

30. olajos, halízű

31. faggyú íz

32. a) oxidált íz

b) fémes íz

33. takarmány íz

34. nyers, keserű

35. túlsózott

36. dohos, bűzös

37. malátaízű

38. vegyszerízű

[1] 2. táblázat

[2] A "jó" minősítésnél említett hibák csak igen kis mértékű eltérések az ideális típustól.

[3] Ezt az elnevezést minél ritkábban alkalmazzuk és csak olyan esetekben, amikor a hibát más módon ennél pontosabban nem lehet leírni.

--------------------------------------------------

VIII. MELLÉKLET

(7. cikk)

VALAMELY ELEMZÉS EREDMÉNYEINEK VITATOTTSÁGA ESETÉN ALKALMAZANDÓ ELJÁRÁS (vegyi elemzés)

1. A piaci szereplő kérésére az első elemzés eredményeiről történt értesítést követő hét munkanapon belül még egy elemzést lehet elvégezni feltéve, hogy a termékből leplombált ellenminták állnak rendelkezésre, és az illetékes hatóságok azokat az előírásoknak megfelelően tárolták.

2. Az illetékes hatóság ezeket a mintákat a piaci szereplő kérésére és költségén egy másik laboratóriumba küldi. Ennek a laboratóriumnak hivatalos elemzések végzésére vonatkozó jóváhagyással és a kérdéses elemzéssel kapcsolatosan bizonyított szakértelemmel kell rendelkeznie. Ezt a szakértelmet együttműködésre alapozott tanulmányokban való sikeres részvétellel, szakmai vizsgával vagy laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálatokkal kell igazolni. A második laboratóriumnak a referenciamódszert kell használnia. A két laboratórium által kapott eredményeket a következőképpen kell értékelni:

a) Amennyiben mindkét laboratórium teljesíti az ismételhetőségi követelményeket, valamint a reprodukálhatósági követelményeket

A kapott vizsgálati eredmények számtani középértékét mindkét laboratórium mint végeredményt jelenti. Ezt a végeredményt a kritikus eltérés figyelembevételével értékelik a következő képlet alkalmazásával:

CrD

- m

1 -

ahol:

- : a két laboratórium által kapott valamennyi eredmény számtani középértéke

mo : a határérték

R : a reprodukálhatóság

r : az ismételhetőség

n1 : az 1-es laboratórium által kapott eredmények száma

n2 : a 2-es laboratórium által kapott eredmények száma.

Megjegyzés:

Amennyiben a végeredmények kiszámításához a következő képletet vették igénybe

x = y

± y

vagy

x = y

(lásd értelemszerűen a IV. melléklet 3. és 4. pontját), a képletbe az R2 és r2 helyett R2x és r2x -et kell behelyettesíteni.

b) Amennyiben mindkét laboratórium teljesíti az ismételhetőségi követelményeket, de nem teljesíti a reprodukálhatósági követelményeket

Amennyiben a második elemzés megerősíti az elsőt, az elemzés alatt álló mennyiséget vissza kell utasítani, mint nem megfelelőt. Ellenkező esetben a tételt el kell fogadni.

c) Amennyiben csupán az egyik laboratórium teljesíti az ismételhetőségi követelményeket

Az ismételhetőségi követelményeket teljesítő laboratórium által kapott végeredmény figyelembevételével kell eldönteni, hogy elfogadható-e a vizsgált mennyiség.

d) Amennyiben egyik laboratórium sem teljesíti az ismételhetőségi követelményeket, de a reprodukálhatósági követelmények teljesülnek

az a) pont alkalmazható.

e) Amennyiben egyik laboratórium sem teljesíti sem az ismételhetőségi követelményeket, sem a reprodukálhatósági követelményeket

A vizsgált mennyiséget el kell fogadni, ha valamelyik laboratórium által nyert eredményekből ez a következtetés vonható le.

f) Amennyiben a kapott eredmények nem érvényesített módszer használatából erednek

A vizsgált mennyiséget el kell fogadni, ha valamelyik laboratórium által nyert eredményekből ez a következtetés vonható le.

3. A második elemzés eredményeiről az illetékes hatóság köteles haladéktalanul a piaci szereplőt értesíteni. Amennyiben a vizsgált mennyiséget nem fogadták el, a második elemzés költségeit a piaci szereplő viseli.

4. Amennyiben a piaci szereplő a mintavételtől számított öt munkanapon belül bizonyítani tudja, hogy a mintavételt nem végezték el helyesen, a mintavételt - ha lehetséges - meg kell ismételni. Amennyiben a mintavétel nem ismételhető meg, a vizsgált mennyiséget el kell fogadni.

--------------------------------------------------

IX. MELLÉKLET

(8. cikk)

VAJ VÍZTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1. Tárgy és alkalmazási terület

Ez a referenciamódszer a vaj víztartalmának megállapítására alkalmas módszert határozza meg.

2. Hivatkozás

Az 50 C: 1995 IDF-szabvány - Tej és tejtermékek - Mintavételi módszerek

3. Fogalommeghatározás

A vaj víztartalma: az ebben a szabványban meghatározott hevítés befejezése után mért tömegveszteség. Kifejezése gramm per 100 grammban történik.

4. A módszer elve

A víz elpárologtatása a vizsgálati anyagból horzsakő jelenlétében 102 °C hőmérsékleten, szárítószekrényben.

5. Eszközök és anyagok

A szokásos laboratóriumi eszköz és különösen a következők:

5.1. Analitikai mérleg, 1 mg-os pontosságú.

5.2. Exszikkátor, megfelelő szárítószerrel (például frissen szárított szilikagél higroszkópos indikátorral).

5.3. Szárítószekrény, szellőztetett, termosztáttal vezérelt, teljes munkaterében 102 ± 2 °C-on üzemelő.

5.4. Üveg, porcelán vagy rozsdamentes fémedények, megközelítőleg 20 mm-es magassággal és 60 és 80 mm közötti átmérővel.

5.5. Zúzott és mosott horzsakő, mintegy 0,8-10 mm átmérőjű szemcsemérettel.

6. Mintavétel

Lásd az 50 C: 1995 IDF-szabványt.

7. Vizsgálati eljárás

7.1. A vizsgálati minta előkészítése

A laboratóriumi mintát lezárt, üvegből vagy megfelelő műanyagból készült, feléig-kétharmadáig töltött edényben melegítsük olyan hőmérsékletűre, amelynél a minta eléggé meglágyul ahhoz, hogy homogén állapotúra lehessen keverni (akár mechanikus rázógéppel, akár kézzel). A keverési hőmérsékletnek rendes esetben ne haladja meg a 35 °C-ot. Hűtsük le a mintát szobahőmérsékletűre. A mintát tartó edényt a lehűlést követően, amilyen gyorsan csak lehet, nyissuk ki, és mérés előtt röviden keverjük fel (10 másodpercnél nem hosszabb ideig) egy arra alkalmas eszközzel, például kanállal vagy spatulával.

7.2. A víztartalom meghatározása

7.2.1. Megközelítőleg 10 g horzsakövet helyezzünk az edénybe (5.4.).

7.2.2. Legalább egy órán keresztül szárítsuk az edényt a horzsakővel együtt a szárítószekrényben (5.3.) 102 ± 2 °C hőmérsékleten.

Megjegyzés:

a 7.2.2., a 7.2.5., valamint a 7.2.7. pontban említett szárítási időszak akkor kezdődik, amikor a szárítószekrény elérte a 102 ± 2 °C hőmérsékletet.

7.2.3. Az exszikkátorban (5.2.) hagyjuk az edényt a mérőszoba hőmérsékletére lehűlni, majd mérjük meg 1 mg-os pontossággal.

7.2.4. A vizsgálati mintából mérjünk be az edénybe 1 mg-os pontossággal körülbelül 5 g vizsgálati anyagot.

7.2.5. Helyezzük az edényt a szárítószekrénybe és hagyjuk ott három órán keresztül 102 ± 2 °C-on.

7.2.6. Hagyjuk, hogy az edény az exszikkátorban a mérőszoba hőmérsékletéig hűljön vissza, majd mérjük meg 1 mg-os pontossággal.

7.2.7. Ismételjük meg a szárítási folyamatot további egy órás időszakonként, hűtéssel és méréssel, minden alkalommal a 7.2.6. pontban leírtak szerint, tömegállandóságig (ez azt jelenti, hogy a tömegváltozás ne haladja meg az 1 mg-ot).

Amennyiben a tömeg növekszik, a legalacsonyabb rögzített tömegértékkel kell számolni.

8. Az eredmények kifejezése

8.1. A számítás módszere és képlete

A W-víztartalmat tömegszázalékban a következő összefüggés segítségével számítjuk ki:

W =

- m

× 100

ahol:

m0 az edény és a horzsakő együttes tömege grammban (7.2.3.)

m1 a vizsgálati anyag, az edény és a horzsakő együttes tömege grammban, szárítás előtt (7.2.4.)

m2 a vizsgálati anyag, az edény és a horzsakő együttes tömege grammban, szárítás után (7.2.7.)

Az eredményeket egy tizedesjegy pontossággal adjuk meg.

8.2. Ismételhetőség

Az egyidőben vagy rövid időeltéréssel, egymás után, ugyanazon laboratóriumi személyzet által, azonos feltételek mellett, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két egyedi vizsgálat abszolút különbsége nem haladhatja meg a 0,2 %-ot.

8.3. Reprodukálhatóság

A különböző laboratóriumban, eltérő laboratóriumi személyzet által azonos vizsgálati anyag elemzésével nyert két egyedi, egymástól független eredmény abszolút különbsége nem haladhatja meg a 0,3 %-ot.

9. Vizsgálati jegyzőkönyv

A vizsgálati jegyzőkönyv meghatározza az elemzésre használt módszert és a kapott eredményeket. Ezen felül megemlít minden olyan alkalmazott részletet, amely a nemzetközi szabvány leírásában nem szerepel, vagy amely nem kötelező, olyan egyéb körülmény részletezésével, amely a kapott eredményeket befolyásolhatta. A vizsgálati jegyzőkönyv megadja az összes, a minta teljes azonosításához szükséges információt is.

--------------------------------------------------

X. MELLÉKLET

(8. cikk)

VAJ: ZSÍRMENTES SZÁRAZANYAG-TARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1. Tárgy és alkalmazási terület

Ez a szabvány a vaj zsírmentes szárazanyag-tartalmának meghatározására szolgáló módszert ismerteti.

2. Hivatkozás

Az 50 C: 1995 IDF-szabvány - Tej és tejtermékek - Mintavételi módszerek

3. Fogalommeghatározás

A vaj zsírmentes szárazanyag-tartalma: A meghatározott módszerrel meghatározott anyagok tömegszázaléka. Kifejezése gramm per 100 grammban történik.

4. A módszer elve

Vaj ismert tömegéből a víz elpárologtatása után a zsírt petroléterrel kivonjuk, majd a visszamaradt anyagot megmérjük.

5. Vegyszerek

30 és 60 °C közötti forráspontú tartománnyal rendelkező petroléter. A vegyszer 100 milliliterének elpárologtatása után 1 mg visszamaradt anyagnál több nem maradhat.

6. Eszközök és anyagok

6.1. Analitikai mérleg, 1 mg-os pontosságú.

6.2. Exszikkátor, megfelelő szárítószerrel (például frissen szárított szilikagél higroszkópos indikátorral).

6.3. Szárítószekrény, szellőztetett, termosztáttal vezérelt, teljes munkaterében 102 ± 2 °C-on üzemelő.

6.4. Üveg, porcelán vagy rozsdamentes fémedények, megközelítőleg 20 mm-es magassággal és 60 és 80 mm közötti átmérővel, keverő üvegbottal ellátva.

6.5. Zúzott és mosott horzsakő, mintegy 16-40 μm átmérőjű szemcsemérettel.

7. Mintavétel

Lásd az 50 C: 1995 IDF-szabványt.

8. Vizsgálati eljárás

8.1. A vizsgálati minta előkészítése

8.2. Meghatározás

8.2.1. Szárítsuk az edényt az üvegbottal (6.4.) és a szűrőtégellyel (6.5.) együtt a szárítószekrényben (6.3.) egy órán keresztül. Hagyjuk ezeket a tárgyakat lehűlni az exszikkátorban, majd mérjük meg őket együtt (vagyis az edényt, az üvegbotot és a tégelyt) 1 mg-os pontossággal (m0).

Megjegyzés:

- Szabály szerint elegendő 45 perc hűtési idővel számolni,

- Fontos, hogy ugyanazt az edény-, üvegbot- és szűrőtégely-kombinációt alkalmazzuk minden egyes vizsgálati adagnál, ha egynél többet elemzünk egy tételen belül.

8.2.2. Vegyük le a szűrőtégelyt, és 1 mg-os pontossággal jegyezzük fel az edény és az üvegbot együttes tömegét (m1).

8.2.3. A vizsgálati mintából (8.1) mérjünk be az edénybe 1 mg-os pontossággal körülbelül 5 g tömegű vizsgálati adagot (m2).

8.2.4. Helyezzük a vajat és az üvegbotot tartalmazó edényt a szárítószekrénybe, és hagyjuk ott 102 ± 2 °C-on egy éjszakán keresztül.

8.2.5. Hagyjuk, hogy az edény (8.2.3.) szobahőmérsékletűre hűljön vissza.

8.2.6. Öntsünk 15 ml meleg (megközelítőleg 25 °C-os) petrolétert az edénybe, és az üvegbot segítségével válasszunk le az edény falához tapadó üledékből amennyit csak lehet. Az oldatot vigyük át a tégelybe és hagyjuk, hogy az átszűrődjön a szívópalackba.

8.2.7. Még további négy alkalommal ismételjük meg a 8.2.6. pontban meghatározott műveletet. Amennyiben az edény felületén már nyomokban sem marad zsír, a negyedik mosás alkalmával az üledékből annyit, amennyit csak lehetséges, vigyünk át a szűrőtégelybe. Ellenkező esetben addig ismételjük a 8.2.6. pontban meghatározott műveletet, míg a zsír teljes egészében el nem tűnik.

8.2.8. A szűrőtégelyben az üledéket 25 ml meleg petroléterrell mossuk át.

8.2.9. Szárítsuk az edényt, valamint az üvegbotot és a szűrőtégelyt együtt a szárítószekrényben 102 ± 2 °C-on 30 percig.

8.2.10. Az exszikkátorban hagyjuk szobahőmérsékletre visszahűlni, majd mérjük meg 1 mg-os pontossággal.

8.2.11. Ismételjük meg a 8.2.9. és 8.2.10. pontban említett műveleteket az edény, üvegbot és szűrőtégely együttesének tömegállandóságáig (amíg a tömegváltozás nem haladja meg az 1 mg-ot) (m3).

9. Az eredmények kifejezése

9.1. A zsírmentes szárazanyag-tartalom kiszámítása

A zsírmentes szárazanyag-tartalmat (SNF) tömegszázalékban a következő képlet alkalmazásával számítjuk ki:

SNF =

- m

× 100

ahol:

m0 az üres edény, az üvegbot és a szűrőtégely együttes tömege grammban (8.2.1.)

m1 üres edény és az üvegbot együttes tömege grammban (8.2.2.)

m2 a vizsgálati adag, az edény és az üvegbot együttes tömege grammban (8.2.3.)

m3 az edényben maradt üledék, az edény, az üvegbot és a szűrőtégely végső együttes tömege grammban (8.2.11.)

Az eredményeket egy tizedesjegy pontossággal adjuk meg.

9.2. Ismételhetőség

Az egyidőben vagy rövid időeltéréssel, egymás után, ugyanazon laboratóriumi személyzet által, azonos feltételek mellett vagy azonos vizsgálati anyagon elvégzett két egyedi abszolút különbsége ne haladja meg a 0,1 %-ot.

9.3. Reprodukálhatóság

10. Vizsgálati jegyzőkönyv

Megjegyzés:

Ha sózott vajat elemzünk, a hozzáadott sót zsírmentesen szárazanyagként határozzuk meg. A zsírmentes tejszárazanyag-tartalom meghatározásához a hozzáadott só mennyiségét le kell vonni a zsírmentes szárazanyag mennyiségéből. A zsírmentes tejszárazanyag-tartalom meghatározásához a számított pontossági értékek a következők:

Ismételhetőség : r = 0,104 %

Reprodukálhatóság : R = 0,206 %

Megállapítható, hogy a zsírmentes szárazanyag meghatározására kapott pontossági értékek érvényesek a zsírmentes tejszárazanyag-tartalom meghatározására is.

--------------------------------------------------

XI. MELLÉKLET

(8. cikk)

VAJ ZSÍRTARTALMÁNAK MEGHATÁTOZÁSA

A zsírtartalmat közvetett úton, a víztartalomnak a IX. mellékletben, illetve a zsírmentes szárazanyag-tartalomnak a X. mellékletben ismertetett meghatározása útján számítjuk ki. A zsír tömegszázaléka egyenlő

100 -

W+SNF

ahol:

W : a víz mennyisége tömegszázalékban

SNF : a zsírmentes szárazanyag-tartalom tömegszázalékban

A zsírtartalom meghatározásához a számított pontossági értékek a következők:

Ismételhetőség: | r = 0,22 % |

Reprodukálhatóság: | R = 0,36 %. |

--------------------------------------------------

XII. MELLÉKLET

(9. cikk)

VANILLINTARTALOM MEGHATÁROZÁSA NAGY TELJESÍTMÉNYŰ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL VAJKONCENTRÁTUMBAN, VAJBAN VAGY TEJSZÍNBEN

1. Tárgy és alkalmazási terület

Ez a módszer a vajkoncentrátum, vaj és tejszín vanillintartalmának mennyiségi meghatározására alkalmas eljárást ismerteti.

2. A módszer elve

Ismert mennyiségű minta extrahálása izopropanol, etil-alkohol, valamint acetonitril 1:1:2 arányú keverékével. A zsír nagy részének kicsapása -15 °C és -20 °C-os hőmérsékletre történő hűtéssel és azt követő centrifugálással.

Vízzel történt hígítás után a vanillintartalmat nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás módszerrel lehet meghatározni (HPLC).

3. Eszközök

A szokásos laboratóriumi eszköz, valamint különösen a következők:

3.1. fagyasztó, amely -15 °C és -20 °C hőmérséklet közötti tartományban üzemel;

3.2. eldobható, 2 ml űrtartalmú fecskendők;

3.3. membrános mikroszűrők 0,45 μm pórusmérettel, amelyek ellenállóak az 5 % extraháló oldatot tartalmazó folyadékkal szemben (4.4.);

3.4. folyadékkromatográfiás rendszer, amely egy szivattyúból (1,0 ml/min átfolyási teljesítmény), egy injektorból (20 μl automatikus vagy kézi befecskendezés), egy UV-detektorból (306 nm-en üzemelő, 0,01 AU a teljes skálán), egy rögzítő vagy integráló eszközből, valamint egy 25 °C-on üzemelő termosztátoszlopból áll;

3.5. analitikai oszlop (250 mm × 4,6 mm ID) LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm), vagy azzal egyenértékű anyaggal töltve;

3.6. védőoszlop (kb. 20 mm × 3 mm ID) Perisorb RP 18 (30-40 μm), vagy azzal egyenértékű anyaggal szárazon töltve.

4. Vegyszerek

Az összes felhasznált vegyszernek elismert analitikai minőségűnek kell lennie.

4.1. Izopropanol

4.2. Etil-alkohol 96 %(térfogatszázalék)

4.3. Acetonitril

4.4. Extraháló oldat

Keverjük össze az izopropanolt (4.1.), etil-alkoholt (4.2.) és acetonitrilt (4.3.) 1:1:2 (v/v) térfogat arányban.

4.5. Vanillin (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid)

4.5.1. Vanillintörzsoldat (= 500 μg/ml)

Mérjünk ki egy 100 ml-es térfogatmérő lombikba pontosan 0,1 mg-os pontossággal 50 mg (CM mg) vanillint (4.5.), adjunk hozzá 25 ml extraháló oldatot (4.4.), és egészítsük ki vízzel.

4.5.2. Vanillin standardoldat (=10 μg/ml).

Pipettázzunk 5 ml vanillintörzsoldatot (4.5.1.) egy 250 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikba, és egészítsük ki vízzel.

4.6. Metil-alkohol, HPLC-minőség

4.7. Ecetsav, jégecet formában

4.8. Víz, HPLC-minőség

4.9. HPLC-mobilfázis

Keverjünk el egy 1000 ml-es térfogatmérő lombikban 300 ml metil-alkoholt (4.6.) és 20 ml ecetsavat (4.7.) körülbelül 500 ml vízzel (4.8.), és egészítsük ki vízzel (4.8.). Szűrjük át a 0,45 μm pórusátmérőjű szűrőn (3.3.).

5. Vizsgálati eljárás

5.1. A vizsgálati minta előkészítése

5.1.1. Vaj

Addig melegítsük a mintát, amíg olvadni kezd. Kerüljük a helyi túlmelegedést 40 °C hőmérséklet felett. Amikor a minta már kellően lággyá vált, rázással keverjük el. A vajat 15 másodpercen át keverjük mielőtt mintát vennénk belőle. Mérjünk le egy 100 ml-es térfogatmérő lombikba 1 milligrammos pontossággal körülbelül 5 g (SM g) vajat.

5.1.2. Vajkoncentrátum

Közvetlenül mintavétel előtt helyezzük a vajkoncentrátumot tartalmazó edényt 40 és 50 °C közötti hőmérsékleten egy szárítószekrénybe, amíg teljesen meg nem olvad. A mintát ezután keveréssel, rázogatással keverjük el, kerülve a túl heves rázás okozta légbuborékok képződését. Mérjünk ki egy 100 ml-es térfogatmérő lombikba 1 milligrammos pontossággal körülbelül 4 g (SM g) vajkoncentrátomot.

5.1.3. Tejszín

Vízfürdőben vagy inkubátorban melegítsük a mintát 35 és 40 °C hőmérséklet között. Keveréssel, vagy szükség esetén rázogatással, egyenletesen oszlassuk el a zsírt. Hűtsük le gyorsan a mintát 20 ± 2 °C hőmérsékletre. A mintának egyenletesnek kell lennie, ellenkező esetben az eljárást ismételjük meg. Mérjünk le egy 100 ml-es térfogatmérő lombikba 1 milligrammos pontossággal körülbelül 10 g (SM g) tejszínt.

5.2. A vizsgálati oldat elkészítése

Adjunk hozzá 75 ml extraháló oldatot (4.4.) a vizsgálati adaghoz (5.1.1., 5.1.2. vagy 5.1.3.), erősen kavarjuk vagy rázzuk fel körülbelül 15 percig és egészítsük ki az extraháló oldattal (4.4.). Ebből az extraktumból vigyünk át körülbelül 10 ml mennyiséget egy dugóval ellátott kémcsőbe. Tegyük a kémcsövet fagyasztóba (3.1.), és hagyjuk ott állni körülbelül 30 percen át. Centrifugáljuk a hideg extraktumot 5 percig megközelítőleg percenkénti 2000-es fordulatszámon és azonnal dekantáljuk. A dekantált oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni. Pipettázzunk 5 ml dekantált oldatot egy 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikba, és egészítsük ki vízzel. Egy adagot szűrjünk le a membrános mikroszűrőn (3.3.). A szűrlet most már készen áll a HPLC-s vizsgálatra.

5.3. Kalibrálás

Pipettázzunk 5 ml vanillin standardoldatot (4.5.2.) egy 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikba. Adjunk hozzá 5 ml extraháló oldatot (4.4.), és jelig egészítsük ki vízzel. Ez az oldat 0,5 μg/ml vanillint tartalmaz.

5.4. Meghatározás HPLC-módszerrel

Engedjük, hogy a kromatográfiás rendszer körülbelül 30 percig stabilizálódjon. Injektáljuk a standardoldatot (5.3.). Addig ismételjük ezt a műveletet, míg két egymást követő befecskendezés után a csúcs alatti területek, illetve a csúcsok magassága közötti különbség kisebb nem lesz, mint 2 %. Az meghatározott feltételek mellett a vanillin retenciós ideje körülbelül 9 perc. A standardoldatot (5.3.) 20 μl befecskendezésével kettős próbában elemezzük. Injektáljunk 20 μl mintát (5.2.). Határozzuk meg a kapott vanillincsúcs magasságát vagy a görbe alatti területet. A vizsgálati minta (5.2.) tíz befecskendezését követően ismételjük meg a standardoldat kettős befecskendezését (5.3.).

6. Az eredmények kiszámítása

Számítsuk ki az egyes vizsgálati oldattételeket közrefogó kettős standardhoz tartozó vanillincsúcsok csúcs alatti területének átlagos nagyságát (vagy magasságát) (AC) (összesen négy terület, illetve magasság).

Számítsuk ki a választényezőt (R):

R = AC/CM

ahol CM a vanillin tömege milligrammban (4.5.1.).

A vizsgálati mintában található vanillintartalom (mg/kg) (C) a következő összefüggés alapján számítható ki:

C =

AS × 20 × 0,96SM × R

ahol:

AS = a vizsgálati minta vanillincsúcsának csúcsterülete

SM =

a vizsgálati minta tömege grammban (5.1.1., 5.1.2. vagy 5.1.3.).

Ha tejszínt elemzünk vanillinra, a jelölőanyag koncentrációját az egy kilogramm tejzsírra eső jelölőanyag milligrammjában kell kifejezni. Ezt úgy tehetjük meg, hogy a C-értéket megszorozzuk 100/f-el. Az f a tejszín zsírtartalma százalékban megadva (m/m).

20 = a standardoldat, valamint a vizsgálati minta hígítását figyelembe vevő korrekciós tényező

0,96 = a vizsgálati minta első hígításában található zsírtartalomra meghatározott korrekciós tényező

Megjegyzés:

A csúcsterület helyett a csúcsok magasságát is használhatjuk (lásd a 8.3. pontot).

7. A módszer pontossága

7.1. Ismételhetőség (r)

A lehető legrövidebb időeltéréssel, ugyanazon laboratóriumi személy által, azonos felszerelésekkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a 16 mg/kg-ot.

7.2. Reprodukálhatóság (R)

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által, különböző eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a 27 mg/kg-ot.

8. Tűréshatárok

8.1. A megjelölt termékből a homogenitás ellenőrzése érdekében három mintát kell venni.

8.2. A jelölőanyagot vagy vaníliából vagy szintetikus vanillinből nyerjük:

8.2.1. A 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid hozzákeverési aránya 250 g a vajkoncentrátum vagy a vaj tonnájára. Amennyiben a tejszínnél alkalmazzuk a megjelölést, a hozzákeverési arány 250 g a tejzsír tonnájára számolva.

8.2.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag mennyiségének és egyenletes eloszlásának ellenőrzésére alkalmazzák, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni [figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést (DCr 95)]:

- 221,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a),

- 159,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 221,0 mg/kg és 159,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

8.3. Kizárólag vaníliatermésből vagy annak teljes értékű kivonatából előállított jelölőanyag:

8.3.1. A 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid hozzákeverési aránya 100 g a vajkoncentrátum vagy a vaj tonnájára. Amennyiben a tejszínnél alkalmazzuk a megjelölést, a hozzákeverési arány 100 g a tejzsír tonnájára számolva.

8.3.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag mennyiségének és egyenletes eloszlásának ellenőrzésére alkalmazzák, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni [figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést (DCr 95)]:

- 79,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a),

- 54,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 79,0 mg/kg és 54,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

9. Megjegyzések

9.1. Ismételhetőség (r) az az érték, amellyel, egy meghatározott valószínűséggel, egybeesik az azonos eljárással, azonos vizsgálati anyagon és azonos feltételek mellett (ugyanaz az eszköz, ugyanaz a laboratórium, igen rövid időeltéréssel) elvégzett két egyedi vizsgálat eredményének abszolút különbsége; egyéb jelzés hiányában a valószínűség 95 %.

9.2. Reprodukálhatóság (R) az az érték, amellyel, egy meghatározott valószínűséggel, egybeesik az azonos eljárással, azonos vizsgálati anyagon, de eltérő feltételek mellett (más laboráns, más eszköz, más laboratórium, és/vagy eltérő időben) elvégzett két egyedi vizsgálat eredményének abszolút különbsége; egyéb jelzés hiányában a valószínűség 95 %.

9.3. A hozzáadott vanillin visszanyerési aránya 250 mg/kg vajolajnál 97,0 és 103,8 között változik. A kapott átlagos vanillintartalom 99,9 % volt 2,7 % szórás mellett.

9.4. A vizsgálati mintában található 5 %-os extraháló oldat jelenléte által okozott csúcskiszélesedés ellensúlyozása érdekében a standardoldat 5 %-os extraháló oldatot tartalmaz. Ezáltal lehetővé válik a mennyiségi meghatározás a csúcsmagasság alapján is.

9.5. Az elemzés lineáris kalibrációs görbén alapszik, amely nulla beosztással rendelkezik.

A standardoldat megfelelő hígításainak alkalmazásával (4.5.2.) a linearitást az elemzés első alkalommal történő elvégzésekor ellenőrizni kell, a későbbiekben rendszeres időközönként, valamint a HPLC-eszközben történt változtatás, illetve annak javítása után.

--------------------------------------------------

XIII. MELLÉKLET

(9. cikk)

BÉTA-APO-8'-KAROTINSAV ETIL-ÉSZTERÉNEK MEGHATÁROZÁSA VAJKONCENTRÁTUMBAN ÉS VAJBAN SPEKTROMÉTERREL

1. Tárgy és alkalmazási terület

A módszer a béta-apo-8'-karotinsav etil-észterének (apo-karotén-észter) vajkoncentrátumból és vajból való mennyiségi meghatározására alkalmas eljárást ismerteti. Az apo-karotén-észter mindazon anyagok összessége, amelyek a módszerben meghatározott feltételek mellett készített minta kivonatában jelen vannak, és a fényt 440 nm-en elnyelik.

2. A módszer elve

A vajzsírt petroléterben feloldjuk és fényelnyelését 440 nm-es hullámhosszon megmérjük. Az apo-karotén-észter-tartalom meghatározása egy külső standarddal való egybevetés útján történik.

3. Eszközök

3.1. Pipetták - beosztással ellátott, 0,25, 0,50, 0,75 és 1,0 ml űrtartalommal

3.2. Spektrofotométer - 440 nm (és 447-449 nm közötti) hullámhosszon való mérésre alkalmas és 1 cm hosszú fényúttal rendelkező küvettákkal felszerelve

3.3. 20 ml és 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikok

3.4. Analitikai mérleg, 0,1 mg pontossággal.

4. Vegyszerek

Valamennyi vegyszernek elismert analitikai minőségűnek kell lennie.

4.1. Apo-karotén-észter szuszpenzió (megközelítőleg 20 %-os)

4.1.1. A szuszpenzió tartalmát a következőképpen állapítjuk meg:

Mérjünk ki megközelítőleg 400 mg-ot egy térfogatmérő lombikba (100 ml), oldjuk fel 20 ml kloroformban (4.4.), és egészítsük ki jelig ciklohexánnal (4.5.). Ebből az oldatból 5 ml-t ciklohexánnal hígítsunk fel 100 ml-re (A-oldat). Az A-oldatból 5 ml-t ciklohexánnal hígítsunk fel 100 ml-re. Mérjük meg az elnyelését 447-449 nm hullámhosszon (a maximumot vakpróbaként, ciklohexán ellenében mérjük ki 1 cm hosszú fényúttal rendelkező üvegküvettákat használva).

Apo-karotén-észter-tartalom

A max · 40000A · 2550

Amax = a mérőoldat elnyelése a maximumnál

A = a minta súlya (grammban)

2550 = referencia A-érték (1 %, 1 cm)

A szuszpenzió tisztasága P ( %).

Megjegyzés:

Az apo-karotén-észter levegőre, hőre és fényre egyaránt érzékeny. A felnyitatlan, eredeti tároló edényben (amelyet nitrogén atmoszférában zárnak le), hűvös helyen körülbelül 12 hónapig tárolható. A felnyitás után azonban az edény tartalmát rövid időn belül el kell használni.

4.1.2. Apo-karotén-észter-standardoldat, megközelítőleg 0,2 mg/ml töménységben

Mérjünk ki 0,1 mg pontossággal körülbelül 0,100 grammot az apo-karotén-észter-szuszpenzióból (4.1.1.) (Wg), oldjuk fel petroléterben (4.2.), majd az egész mennyiséget vigyük át egy 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikba és petroléterrel egészítsük ki a jelig.

Ez az oldat (W.P)/10 mg/ml apo-karotén-észtert tartalmaz.

Megjegyzés:

Az oldatot sötét és hűvös helyen kell tárolni. A fel nem használt oldatot egy hónap elteltével ki kell önteni.

4.2. Petroléter (40-60 °C).

4.3. Nátrium-szulfát, kristályvíz nélkül, szemcsés, előzetesen 102 °C hőmérsékleten két órán át szárítva.

4.4. Kloroform

4.5. Ciklohexán

5. Vizsgálati eljárás

5.1. A vizsgálati minta előkészítése

5.1.1. Vajkoncentrátum

A mintát szárítószekrényben megközelítőleg 45 °C-os hőmérsékleten olvasszuk meg.

5.1.2. Vaj

A mintát szárítószekrényben megközelítőleg 45 °C-os hőmérsékleten olvasszuk meg, majd egy reprezentatív adagot szűrjünk le belőle egy körülbelül 10 gramm, kristályvízmentes nátrium-szulfátot (4.3.) tartalmazó szűrőn, erős természetes és mesterséges fénytől védett környezetben és továbbra is megtartva a 45 °C-os hőmérsékletet. Gyűjtsünk össze elegendő mennyiségű vajzsírt.

5.2. Meghatározás

Mérjünk ki 1 mg pontossággal körülbelül 1 gramm vajkoncentrátumot (vagy kivont vajzsírt (5.1.2.), (Mg). Az egész mennyiséget vigyük át egy 20 ml (Vml) űrtartalmú térfogatmérő lombikba, és petroléterrel egészítsük ki a jelig, majd alaposan keverjük el.

Egy adagot tegyünk bele egy 1 cm-es küvettába, és mérjük meg az elnyelését a petroléterkontrollal szemben 440 nm hullámhosszon. Az apo-karotén-észter koncentrációját az oldatban a kalibráló görbével való összehasonlításban kapjuk meg (C μ/ml).

5.3. Kalibrációs görbe

Pipettázzunk 0, 0,25, 0,5, 0,75, valamint 1,0 ml apo-karotén-észter-standardoldatot (4.1.2.) öt darab, 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikba. Töltsük fel teljes térfogatra petroléterrel (4.2.), és keverjük el.

Az oldatok közelítőleges koncentrációi 0-tól 2 μg/ml-ig terjednek, és a standardoldat koncentrációjával egybevetve pontosan számoljuk ki (4.1.2.) (W.P)/10 mg/ml. Mérjük meg a fényelnyelést 440 nm-en a petroléterkontroll ellenében (4.2.).

Az elnyelési értékeket ábrázoljuk az y tengelyen, míg az apo-karotén-észter-koncentrációk az x tengelyen legyenek feltüntetve.

6. Az eredmények kiszámítása

6.1. Az apo-karotén-észter-tartalom mg/kg termékre megadva a következőképpen számítható ki:

Vajkoncentrátum: (C.V)/M

Vaj: 0,82 (C.V)M

ahol:

C = a kalibrációs görbéről leolvasott apo-karotén-észter-tartalom μg/ml-ben (5.3.)

V = a vizsgálati oldat mennyisége milliliterben (5.2.)

M = a vizsgálati anyag tömege grammban (5.2.)

0,82 = korrekciós tényező a vaj vajzsírtartalmára.

7. A módszer pontossága

7.1. Ismételhetőség

7.1.1. Vajelemzés

A lehető legrövidebb időeltéréssel, ugyanazon laboratóriumi személy által, azonos eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg az 1,4 mg/kg-ot.

7.1.2. Vajkoncentrátum-elemzés

7.2. Reprodukálhatóság

7.2.1. Vajelemzés

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által, különböző eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a 4,7 mg/kg-ot.

7.2.2. Vajkoncentrátum-elemzés

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által, különböző eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg az 5,3 mg/kg-ot.

7.3. A pontossági adatok forrása

A pontossági adatokat egy 1995-ben elvégzett kísérlet szolgáltatta, amelyben 11 laboratórium és 12 - jelölőanyaggal ellátott - vajmintát (hat kettős vak próba) használtak vaj vonatkozásában, és 12 - jelölőanyaggal ellátott - mintát (hat kettős vak próba) sűrített vaj vonatkozásában.

8. Tűréshatárok

8.1. A megjelölt termékből a termék helyes megjelölésének ellenőrzése érdekében három mintát kell venni.

8.2. Vaj

8.2.1. A vaj esetében a hozzákeverési arány, a háttérelnyelést is figyelembevéve, 22 mg/kg.

8.2.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére alkalmazzák, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 18,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a),

- 13,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 18,0 mg/kg és 13,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

8.3. Vajkoncentrátum

8.3.1. A vajkoncentrátum esetében a hozzákeverési arány, a háttérelnyelést is figyelembe véve, 24 mg/kg.

8.3.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére alkalmazzák, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 20,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a),

- 14,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 20,0 mg/kg és 14,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

--------------------------------------------------

XIV. MELLÉKLET

(9. cikk)

SZITOSZTERIN VAGY SZTIGMASZTERIN MEGHATÁROZÁSA VAJBAN VAGY VAJKONCENTRÁTUMBAN KAPILLÁRIS GÁZKROMATOGRÁFIÁVAL

1. TÁRGY ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

Ez a módszer a szitoszterin vagy a sztigmaszterin vajkoncentrátumból és vajból való mennyiségi kimutatására alkalmas eljárást ismerteti. A szitoszterint a β-szitoszterin és 22 dihidro-β-szitoszterin összegének tekintjük, a többi szitoszterint jelentéktelennek tételezzük fel.

2. A MÓDSZER ELVE

A vajat vagy a vajkoncentrátumot kálium-hidroxiddal etil-alkohol oldatban elszappanosítjuk, és az el nem szappanosítható részt dietiléterrel kivonjuk.

A szterinvegyületek trimetil-szilil-éterré alakulnak át, és kapillárison gázkromatográfiás úton elemezhetők egy belső standard/betulin ellenében.

3. ESZKÖZÖK

3.1. 150 ml-es szappanosító lombik visszafolyó hűtővel és csiszoltüveg-csatlakozásokkal ellátva.

3.2. 500 ml-es leválasztó tölcsérek.

3.3. 250 ml-es lombikok.

3.4. Nyomáskiegyenlítő tölcsérek 250 ml vagy ahhoz hasonló űrtartalommal a felesleges dietiléter felfogására.

3.5. Zsugorüvegdugóval ellátott 350 mm×20 mm méretű üvegoszlop.

3.6. Vízfürdő vagy hőntartó köpeny.

3.7. Reakciófiola, 2 ml-es.

3.8. Kapillárissal is használható gázkromatográf, a következő elemekből álló leválasztó rendszerrel ellátva.

3.8.1. Hőszabályozó kamra az oszlopokhoz, amely a kívánt hőmérsékletet ± 1 °C pontossággal tartani képes.

3.8.2. Szabályozható hőmérsékletű párologtató egység.

3.8.3. Lángionizáló detektor és váltó-erősítő.

3.8.4. Rögzítő-integráló készülék, amely alkalmas a váltó-erősítővel (3.8.3.) való használatra.

3.9. Olvasztott szilíciumdioxid-kapilláris teljes egészében bevonva BP1-el vagy azzal egyenértékű anyaggal, egyformán 0,25 μm vastagon; az oszlop tudja felbontani a lanoszterin és szitoszterin trimetilszilil-származékait. 12 méter hosszú, 0,2 mm belső átmérőjű BP1-oszlop a célnak megfelel.

3.10. Edzett hegyű tűvel rendelkező 1 μl-es gázkromatográfiás mikrofecskendő.

4. VEGYSZEREK

Valamennyi vegyszernek elismert analitikai minőségűnek kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy azzal legalább egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie.

4.1. Legalább 95 %-os tisztaságú etil-alkohol.

4.2. Kálium-hidroxid 60 %-os oldata: oldjunk fel 600 g (legalább 85 %-os tisztaságú) kálium-hidroxidot vízben, és vízzel egészítsük ki egy literre.

4.3. Legalább 99 %-os tisztaságú betulin.

4.3.1. Betulin dietiléterben (4.4.) oldott oldata.

4.3.1.1. A szitoszterin meghatározásra használt betulinoldat töménysége 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. A sztigmaszterin meghatározásra használt betulinoldat töménysége 0,4 mg/ml.

4.4. Analitikai tisztaságú dietiléter (peroxidtól és egyéb maradványoktól mentes).

4.5. Kristályvizet nem tartalmazó szemcsés nátrium-szulfát, amelyet előzetesen két órán keresztül 102 °C-on szárítottak.

4.6. Szililáló reagens, például TRI-SIL (beszerezhető a Pierce Chemical vállalattól, katalógusszáma 49001), vagy ezzel egyenértékű más vegyszer.(Fontos tudnivaló: a TRI-SIL gyúlékony, toxikus, maró és esetlegesen rákkeltő anyag. A laboratórium személyzetének ismernie kell a TRI-SIL biztonságossági adatait és meg kell tennie a szükséges óvintézkedéseket.)

4.7. Lanoszterin.

4.8. Szitoszterin, ismert tisztaságú, tisztasága legalább 90 % (P).

1. megjegyzés:

A kalibráláshoz alkalmazott standardanyagok tisztaságát normalizálási módszerrel kell meghatározni. Feltételezzük, hogy az összes, a mintában jelenlévő szterinvegyület megjelenik a kromatogramon, tehát a csúcsok teljes területe a szterinösszetevőket 100 %-ban képviseli, és a szterinek ugyanolyan detektorválaszt váltanak ki. A rendszer linearitását a releváns koncentrációtartományokban érvényesíteni kell.

4.8.1. Szitoszterin-standardoldat - készítsünk dietiléterben (4.4.) 0,001 mg/ml pontossággal, megközelítőleg 0,5 mg/ml (W1) szitoszterint (4.8.) tartalmazó oldatot.

4.9. Sztigmaszterin, ismert tisztaságú, tisztasága legalább 90 % (P).

4.9.1. Sztigmaszterin-standardoldat - készítsünk dietiléterben (4.4.) 0,001 mg/ml pontossággal, megközelítőleg 0,2 mg/ml (W1) sztigmaszterint (4.9.) tartalmazó oldatot.

4.10. Felbontóképességet ellenőrző keverék. Készítsünk dietiléterben (4.4.) 0,05 mg/ml lanoszterint (4.7.) és 0,5 mg/ml szitoszterint (4.8.) tartalmazó oldatot.

5. MÓDSZER

5.1. Standardoldatok készítése kromatográfiás céllal. A belső standardoldatot (4.3.1.) ugyanakkor kell hozzáadni a megfelelő szterin-standardoldathoz, mint amikor az elszappanosított mintához hozzáadjuk (lásd az 5.2.2. pontot).

5.1.1. Kromatográfiás szitoszterin-standardoldat: vigyünk át két reakciófiolába (3.7.) 1-1 ml szitoszterin-standardoldatot (4.8.1.) és a dietilétert nitrogénárammal távolítsuk el. Adjunk hozzá 1 ml belső mintát (4.3.1.1.) és a dietilétert nitrogénárammal távolítsuk el.

5.1.2. Kromatográfiás sztigmaszterin-standardoldat: vigyünk át két reakciófiolába (3.7.) 1-1 ml sztigmaszterin-standardoldatot (4.9.1) és a dietilétert nitrogénárammal távolítsuk el. Adjunk hozzá 1 ml belső standardot (4.3.1.2.) és a dietilétert nitrogénárammal távolítsuk el.

5.2. Nem szappanosítható összetevők előkészítése

5.2.1. A vajmintát 35 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten olvasszuk meg, majd kavarással alaposan keverjük össze.

Egy 150 ml űrtartalmú lombikba (3.1.) mérjünk ki 1 mg pontossággal megközelítőleg 1 g vajat (W2) vagy vajkoncentrátumot (W2). Adjunk hozzá 50 ml etil-alkoholt (4.1.) és 10 ml kálium-hidroxid oldatot (4.2.). Illesszük a visszafolyó hűtőt a helyére és melegítsük megközelítőleg 75 °C-os hőmérsékleten 30 percig. Válasszuk le a hűtőt, és hűtsük le a lombikot megközelítőleg szobahőmérsékletre.

5.2.2. Adjunk hozzá 1,0 ml belső standardoldatot (4.3.1.1.) a lombik tartalmához, ha szitoszterint akarunk meghatározni, vagy ugyanennyit a 4.3.1.2. pontban leírt belső standardoldatból, ha sztigmaszterint akarunk meghatározni. Keverjük össze alaposan. A lombikok tartalmát teljes mennyiségben vigyük át egy 500 ml-es leválasztó tölcsérre (3.2.), majd a lombikot mossuk el 50 ml vízben és 250 ml dietiléterben (4.4.). A leválasztó tölcsért két percen át hevesen rázzuk, majd engedjük, hogy a fázisok elváljanak egymástól. Engedjük le az alsó vizes fázist, az éteres fázist pedig négyszer egymás után 100 ml vízzel rázva mossuk ki.

2. megjegyzés:

Az emulzióképződés elkerülése érdekében lényeges, hogy az első két vizes kimosást gyengéden végezzük (10 felfordítás). A harmadik mosást már 30 másodpercig erősen rázhatjuk. Ha mégis képződik emulzió, azt 5-10 ml etil-alkohol hozzáadásával le lehet bontani. Viszont ha etilalkoholt adtunk hozzá, akkor lényeges még két erőteljes vizes mosás elvégzése.

5.2.3. A tiszta, szappanmentes éterfázist vigyük keresztül egy 30 g, kristályvízmentes nátrium-szulfáttal (4.5.) töltött üvegoszlopon (3.5.). Az étert egy 250 ml űrtartalmú lombikban gyűjtsük (3.3.). Adjunk hozzá egy bugyogáscsökkentő szemcsét, és vízfürdőben vagy hőntartó köpenyben majdnem teljes szárazságig párologtassuk el, óvatosan ügyelve rá, hogy a felesleges oldószert összegyűjtsük.

3. megjegyzés:

Ha a kivont mintákat teljes száradásig túlságosan magas hőmérsékleten tartjuk, előfordulhat, hogy a szterinek egy része elvész.

5.3. A trimetil-szili-éterek előkészítése

5.3.1. A lombikban maradt éteres oldatot 2 ml dietiléterrel vigyük át egy 2 ml-es reakciósfiolába (3.7.), majd az étert nitrogénárammal távolítsuk el. A lombikot még kétszer 2 ml dietiléter adaggal mossuk el, amelyeket szintén a fiolába viszünk át, majd az étert minden esetben nitrogénnel távolítjuk el.

5.3.2. A mintát 1 ml TRI-SIL (4.6.) hozzáadásával szililáljuk. Zárjuk le a fiolát és erőteljesen rázzuk, hogy feloldódjon a reagens. Ha az oldódás nem teljes, 65-70 °C-ra kell felmelegíteni. Hagyjuk legalább öt percig állni, mielőtt befecskendeznénk a gázkromatográfba. A standardokat ugyanúgy szililáljuk, mint a mintákat. Szililáljuk a felbontóképességet ellenőrző keveréket (4.10.) is, ugyanúgy, ahogy a mintákat.

4. megjegyzés:

A szililálást vízmentes környezetben kell végezni. A betulin nem teljes szililálását a betulin csúcsához közeli, második csúcs kialakulása jelzi.

Az etil-alkohol jelenléte a szililáló szakaszban megzavarja a szililálást. Ez a kivonási szakaszt követő, nem megfelelő mosás következménye lehet. Amennyiben a probléma nem oldódik meg, a kivonási szakaszba egy ötödik kimosást is be lehet iktatni, amelynek során 30 másodpercig erőteljesen rázni kell az anyagot.

5.4. Gázkromatográfiás elemzés

5.4.1. Az üzemeltetési feltételek megválasztása

A gázkromatográfot a gyártó utasításai szerint állítsuk össze.

Az üzemeltetési feltételekre vonatkozó irányelvek a következők:

- az oszlop hőmérséklete: 265 °C,

- az injektor hőmérséklete: 265 °C,

- a detektor hőmérséklete: 300 °C,

- a vivőgáz áramlási sebessége: 0,6 ml/perc,

- a hidrogén nyomása: 84 kPa,

- a levegő nyomása: 155 kPa,

- minta leválasztása: 10:1 és 50:1 között; a leválasztási arányt a gyártó utasításai szerint, valamint a detektorválasz linearitása alapján kell optimalizálni, majd a releváns koncentrációtartományon belül érvényesíteni.

5. megjegyzés:

Különösen fontos, hogy az injektáló béléscsövet rendszeresen tisztítsuk.

- a befecskendezett anyag mennyisége: 1 μl TMSE-oldat.

Mielőtt bármiféle elemzéshez hozzákezdenénk, hagyjuk, hogy a rendszer egyensúlyba kerüljön, és kapjunk kielégítő stabil választ.

Ezeket a feltételeket az oszlop, valamint a gázkromatográf jellemző tulajdonságaira tekintettel kell változtatni úgy, hogy olyan kromatogramot kapjunk, amely megfelel a következő követelményeknek:

- a szitoszterincsúcsnak a lanoszterintől kellőképpen el kell válnia. Az 1. ábra azt mutatja, hogy milyennek kell egy szililált felbontóképességet ellenőrző keverékből (4.10.) nyert tipikus kromatogramnak lennie,

- az alább felsorolt szterinek viszonylagos visszatartási ideje megközelítőleg a következő legyen:

koleszterin: 1,0

sztigmaszterin: 1,3

szitoszterin: 1,5

betulin: 2,5

- a betulin retenciós ideje megközelítőleg 24 perc.

5.4.2. Az analitikai eljárás

Fecskendezzünk be 1 μl szililált standardoldatot (sztigmaszterin vagy szitoszterin), majd állítsuk be az integráló készülék kalibrációs paramétereit.

Fecskendezzünk be további 1 μl szililált standardoldatot a betulinra vonatkozó választényező meghatározása érdekében.

Fecskendezzünk be 1 μl szililált mintaoldatot és mérjük meg a csúcsterületeket. Minden kromatográfiás szakaszt a standardok befecskendezésével kell közrefogni.

Iránymutatásként, egy-egy közrefogott szakaszban hat mintát kell injektálni.

6. megjegyzés:

A sztigmaszterin csúcs integrálásakor bele kell számítani a 2b ábra 1., 2. és 3. pontjában meghatározott egybefolyó értékeket is.

Ha a teljes szitoszterinmennyiséget akarjuk értékelni, akkor a szitoszterincsúcs integrálásakor bele kell számítani a 22 dihidro-β-szitoszterin- (sztigmaszterin-) csúcsot is, amely rögtön a szitoszterin után eluálódik (lásd a 3b. ábrát).

6. AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA

6.1. Határozzuk meg a szterincsúcsok és a betulincsúcsok alatti terület nagyságát mindkét - a tételt közrefogó - standardban, majd számítsuk ki az R1-t:

a szterincsúcs alatti átlagos terület a standardbana betulincsúcs alatti átlagos terület a standardban

Határozzuk meg a szterincsúcs alatti területet (sztigmaszterin és szitoszterin), majd a betulincsúcs alatti területet a mintában, és számítsuk ki az R2 -t:

a szterincsúcs alatti terület a mintábana betulincsúcs alatti terület a mintában

W1 = a standard szterintartalma (mg) 1 ml standardoldatban (4.8.1. vagy 4.9.1.)

W2 = a minta súlya (g) (5.2.1.)

P = a standard szterin tisztasági foka (4.8. vagy 4.9.)

A minta szterintartalma

× P × 10

7. A MÓDSZER PONTOSSÁGA

7.1 Vaj

7.1.1. Ismételhetőség

7.1.1.1. Sztigmaszterin

7.1.1.2. Szitoszterin

7.1.2. Reprodukálhatóság

7.1.2.1. Sztigmaszterin

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által, különböző eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a 31,9 mg/kg-ot.

7.1.2.2. Szitoszterin

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által, különböző eszközökkel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a meghatározás középértékéhez viszonyított 8,7 %-ot.

7.1.3. A pontossági adatok forrása

A pontossági adatokat egy 1992-ben elvégzett kísérlet szolgáltatta, amelyben nyolc laboratórium vett részt, és a sztigmaszterint vonatkozásában hat mintát (három azonosítatlan), a szitoszterin tekintetében pedig hat mintát (három azonosítatlan minta) használtak.

7.2. Vajkoncentrátum

7.2.1. Ismételhetőség

7.2.1.1. Sztigmaszterin

7.2.1.2. Szitoszterin

7.2.2. Reprodukálhatóság

7.2.2.1. Sztigmaszterin

7.2.2.2. Szitoszterin

7.2.3. A pontossági adatok forrása

A pontossági adatokat egy 1991-ben elvégzett kísérlet szolgáltatta, amelyben kilenc laboratórium vett részt, és a sztigmaszterin vonatkozásában hat mintát (három azonosítatlan minta), a szitoszterin tekintetében hat mintát (három kettős vak próba) használtak.

8. TŰRÉSHATÁROK

8.1. A megjelölt termékből három mintát kell venni annak ellenőrzésére, hogy a termék megjelölése helyesen történt-e.

8.2. Vaj

8.2.1. Sztigmaszterin

8.2.1.1. A sztigmaszterin esetében a hozzákeverési arány 150 g sztigmaszterin, amely legalább 95 %-os tisztaságú a vaj minden tonnájára, vagyis 142,5 mg/kg, illetve 170 g sztigmaszterin, amely legalább 85 %-os tisztaságú a vaj minden tonnájára, vagyis 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére lehet alkalmazni, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 116,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a a 95 %-os tisztaságú sztigmaszterinre),

- 118,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a a 85 %-os tisztaságú sztigmaszterinre),

- 81,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a a 95 %-os tisztaságú sztigmaszterinre),

- 82,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a a 85 %-os tisztaságú sztigmaszterinre).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 116,0 mg/kg és 81,0 mg/kg közötti, illetve a 118,0 mg/kg és 82,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

8.2.2. Szitoszterin

8.2.2.1. A szitoszterin esetében a hozzákeverési arány 600 g szitoszterin, legalább 90 %-os tisztaságú, a vaj minden tonnájára, vagyis 540 mg/kg.

8.2.2.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére lehet alkalmazni, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 486,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a a 90 %-os tisztaságú szitoszterinre),

- 358,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a a 90 %-os tisztaságú szitoszterinre).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 486,0 mg/kg és 358,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

8.3. Vajkoncentrátum

8.3.1. Sztigmaszterin:

8.3.1.1. A sztigmaszterin esetében a hozzákeverési arány 150 g sztigmaszterin, legalább 95 %-os tisztaságú a vajkoncentrátum minden tonnájára, vagyis 142,5 mg/kg, illetve 170 g sztigmaszterin, legalább 85 %-os tisztaságú a sűrített vaj minden tonnájára, vagyis 144,5 mg/kg.

8.3.1.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére lehet alkalmazni, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 120,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a 95 %-os tisztaságú sztigmaszterinből),

- 122,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a a 85 %-os tisztaságú sztigmaszterinre),

- 84,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a 95 %-os tisztaságú sztigmaszterinből),

- 86,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a a 85 %-os tisztaságú sztigmaszterinre).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 120,0 mg/kg és 84,0 mg/kg közötti, illetve a 122,0 mg/kg és 86,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

8.3.2 Szitoszterin

8.3.2.1. A szitoszterin esetében a hozzákeverési arány 600 g szitoszterin, legalább 90 %-os tisztaságú a vaj minden tonnájára, vagyis 540 mg/kg.

8.3.2.2. A termék elemzéséből kapott három minta eredményét a jelölőanyag-hozzákeverés mennyiségének és homogenitásának ellenőrzésére lehet alkalmazni, és ezek közül az eredmények közül a legalacsonyabbat a következő határértékekkel kell egybevetni (figyelembe véve a 95 %-os valószínűségi szintnél érvényes kritikus eltérést [DCr 95]):

- 486,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 95 %-a a 90 %-os tisztaságú szitoszterinre),

- 358,0 mg/kg (a legkisebb hozzákeverési arány 70 %-a a 90 %-os tisztaságú szitoszterinre).

A legalacsonyabb eredményt adó minta jelölőanyag-koncentrációját használjuk a 486,0 mg/kg és a 358,0 mg/kg közötti interpolációval kapcsolatosan.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

XV. MELLÉKLET

(10. cikk)

JUHTEJBŐL, KECSKETEJBŐL, VAGY BIVALYTEJBŐL, ILLETVE JUH-, KECSKE- VAGY BIVALYTEJ KEVERÉKÉBŐL KÉSZÍTETT SAJTOKBAN TALÁLHATÓ TEHÉNTEJ ÉS KAZEINÁT KIMUTATÁSÁRA ALKALMAS REFERENCIAMÓDSZER

1. Tárgy

Juhtejből, kecsketejből, vagy bivalytejből, illetve juh-, kecske- vagy bivalytej keverékéből készített sajtokban található tehéntej és kazeinátok kimutatása a γ-kazeinek plazminolízisét követő izoelektromos futtatással.

2. Az alkalmazás területe

Ez a módszer alkalmas a kezeletlen és hőkezelt tehéntej, valamint kazeinát nagy érzékenységű és specifikus kimutatására friss és érlelt, juhtejből, kecsketejből, vagy bivalytejből, illetve juh-, kecske- vagy bivalytej keverékéből készített sajtokban. Nem alkalmas azonban a tej és a sajt szarvasmarha eredetű, hőkezelt savófehérje-koncentrátumokkal történt hamisításának kimutatására.

3. A módszer elve

3.1. A kazeinek elkülönítése a sajtból és a referenciastandardból.

3.2. Az izolált kazeinek feloldása és alávetése a plazminos (EC.3.4.21.7.) bontásnak.

3.3. A plazminnal kezelt kazeinek izoelektromos futtatása karbamid jelenlétében, és a fehérjék megfestése.

3.4. A megfestett γ3 és γ2-kazeinmintázatoknak (amelyek a tehéntej jelenlétét bizonyítják) az értékelése a vizsgálati mintákból nyert futtatási mintázatok és az ugyanazon a gélen, a 0 %, illetve az 1 % tehéntejet tartalmazó referenciastandardok futtatásakor kapott mintázatok összehasonlításával.

4. Vegyszerek

Ellenkező rendelkezés hiányában, analitikai tisztaságú vegyszereket kell alkalmazni. A víznek kétszeresen desztilláltnak vagy azzal egyenértékű tisztaságúnak kell lennie.

Megjegyzés:

A következő részletek a laboratóriumban elkészített, karbamidtartalmú poliakrilamid gélekre vonatkoznak, amelyek méretei 265 × 125 × 0,25 mm. Ha más nagyságú vagy más típusú gélt használunk, a leválasztási körülményeket külön be kell állítani.

Izoelektromos futtatás

4.1. Vegyszerek a karbamidtartalmú poliakrilamid gél előállításához

4.1.1. Géltörzsoldat

Oldjuk fel a következőket vízben:

4,85 g akrilamid

0,15 g N, N'-metilén-bisz-akrilamid (BIS)

48,05 g karbamid

15,00 g glicerin (87 % w/w),

egészítsük ki 100 ml-re és hűtőszekrényben, barna üvegben tároljuk.

Megjegyzés:

A fent említett fix tömegű, neurotoxikus akrilamidok helyett előnyösebb lehet a kereskedelemben kapható, előre bekevert akrilamid/BIS-oldat használata. Ha az ilyen oldat 30 % w/v akrilamidot és 0,8 % w/v BIS-t tartalmaz, 16,2 ml térfogatot kell belőle felhasználni a fix tömegek helyett. A törzsoldat eltarthatósági ideje legfeljebb 10 nap; ha vezetőképessége több mint 5 μS, 2 g Amberlite MB-3 vegyszerrel kell 30 percen keresztül történő keverés útján ionmentesíteni, majd egy 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn átszűrni.

4.1.2. Géloldat

Készítsük el a géloldatot úgy, hogy az adalékanyagokat és az amfoter-elektrolitokat elkeverjük a géltörzsoldattal (lásd a 4.1.1. pontot).

9,0 ml törzsoldat

24 mg β-alanin

500 μl 3,5-9,5 pH közötti amfolit [1]

250 μl 5-7 pH közötti amfolit [2]

250 μl 6-8 pH közötti amfolit [3].

Keverjük össze a géloldatot, és vákuumban vagy ultrahangos fürdőben gázmentesítsük két vagy három percen át.

Megjegyzés:

A géloldatot közvetlenül a kiöntés előtt készítsük el (lásd a 6.2. pontot).

4.1.3. Katalizátoroldatok

4.1.3.1. N, N, N' N' - tetrametil-etilén-diamin (Temed).

4.1.3.2. 40 % w/v ammónium-perszulfát (PER):

Oldjunk fel vízben 800 mg PER-t és egészítsük ki vízzel 2 ml-re.

Megjegyzés:

Mindig frissen készített PER-oldatot használjunk.

4.2. Kontaktfolyadék

Világítópetróleum vagy folyékony paraffin

4.3. Anódos oldat

Oldjunk fel vízben 5,77 g foszforsavat (85 % w/w) és egészítsük ki vízzel 100 ml-re.

4.4. Katódos oldat

Oldjunk fel vízben 2,00 g nátrium-hidroxidot és egészítsük ki vízzel 100 ml-re.

A minta előkészítése

4.5. Vegyszerek a fehérjék elkülönítésére

4.5.1. Hígított ecetsav (25,0 ml jégecet vízzel 100 ml-re hígítva)

4.5.2. Diklórmetán

4.5.3. Aceton

4.6. Proteinoldó puffer

Oldjuk fel a következőket:

5,75 g glicerin (87 % w/w)

24,03 g karbamid

250 mg ditio-treitoltvízben, és öntsük fel 50 ml-re

Megjegyzés:

Hűtőszekrényben tárolva eltarthatósági ideje legfeljebb egy hét.

4.7. A kazeinek plazminos emésztésére használt vegyszerek

4.7.1. Ammóniumkarbonát-puffer

Titráljunk 0,05 mol/l etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA, 1,46 g/100 ml) tartalmazó 0,2 mol/l ammónium-hidrogénkarbonát oldatot (1,58 g/100 ml víz) 0,05 mol/l EDTA-t tartalmazó 0,2 mol/l ammónium-karbonát oldattal (1,92 g/100 ml víz) 8 pH-ig.

4.7.2. Szarvasmarhaplazmin (EC.3.4.21.7.), aktivitása legalább 5 U/ml.

4.7.3. ε-aminokapronsav-oldat enzimgátlásra

Oldjunk fel 2,624 g ε-aminokapronsavat (6-amino-n-hexánsav) 100 ml 40 térfogatszázalékos etil-alkoholban.

4.8. Standardok

4.8.1. Bizonylattal ellátott, 0, illetve 1 % tehéntejet tartalmazó, tejoltóenzimmel kezelt fölözött juhtej- és kecsketejkeverék referenciastandard beszerezhető a Referenciaanyagok és Mérések Bizottsági Intézeténél, B-2440 Geel, Belgium.

4.8.2. Tejoltóenzimmel kezelt bivalytejből előállított, 0 és 1 % tehéntejet tartalmazó laboratóriumi belső standard készítése.

A fölözött tejet nyers, ömlesztett bivalytejből, illetve szarvasmarha tejből 37 °C-on, 2500 g-vel 20 percen át történő centrifugálással készítjük. Miután a centrifugacsövet a tartalmával együtt gyorsan 6-8°C-ra hűtöttük le, a felső, zsíros réteget teljes mértékben eltávolítjuk. Az 1 %-os standard elkészítéséhez 1 literes főzőpohárban adjunk 5,00 ml fölözött szarvasmarhatejet 495 ml fölözött bivalytejhez, pH-ját 10 súly/térfogatszázalékos hígított tejsav segítségével állítsuk be 6,4-re. A hőmérsékletet állítsuk be 35 °C-ra és adjunk hozzá 100 μl borjúból származó oltót (oltó aktivitása 1:10000, c. 3000 U/ml), egy percen keresztül kavarjuk, majd a főzőpoharat alufóliával letakarva hagyjuk egy órán át 35 °C-on pihenni az alvadék kialakulásának elősegítésére. Miután az alvadék kialakult, a teljes beoltott tejet előzetes homogenizálás és a savó leszívása nélkül fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárítást követően az anyagot finomra daráljuk, amíg homogén port nem kapunk. A 0 %-os standard elkészítéséhez ugyanezt a műveletsort a tiszta fölözött bivalytejjel kell elvégezni. A standardokat -20 °C-on kell tárolni.

Megjegyzés:

Ajánlatos a bivalytej tisztaságát a standardok elkészítése előtt a plazminos emésztéssel előkészített kazeinek izoelektromos futtatásával ellenőrizni.

A fehérje festéséhez használt vegyszerek

4.9. Fixálószer

Oldjunk fel vízben 150 g triklórecetsavat, és egészítsük ki vízzel 1000 ml-re.

4.10. Festékkivonó oldat

Oldjunk fel 500 ml metil-alkoholt és 200 ml jégecetet 2000 ml desztillált vízben.

Megjegyzés:

A festékkivonó oldatot minden nap frissen készítsük el; elkészíthető 50 % térfogatszázalékos metilalkohol- és 20 térfogatszázalékos jégecettörzsoldat egyenlő mennyiségeinek az összekeverésével.

4.11. Festőoldatok

4.11.1. Festőoldat (1. számú törzsoldat)

Mágneses keverő alkalmazásával oldjunk fel 3,0 g Coomassie G-250 brillantkéket (C.I. 42655) 1000 ml 90 térfogatszázalékos metil-alkoholban (megközelítőleg 45 percen át), és két, közepes sebességű, redőzött szűrőn szűrjük át.

4.11.2. Festőoldat (2. számú törzsoldat)

Oldjunk fel 5,0 g rézszulfát-pentahidrátot 1000 ml 20 térfogatszázalékos jégecetben.

4.11.3. Festőoldat (munkaoldat)

Közvetlenül festés előtt öntsünk össze 125 ml-t mindkét törzsoldatból (4.11.1., 4.11.2.).

Megjegyzés:

A festőoldatot a felhasználás napján kell elkészíteni.

5. Eszközök

5.1. Üveglemezek (265 × 125 × 4 mm); gumihenger (15 cm széles); szintező asztal.

5.2. Gélhordólemez (265 × 125 mm).

5.3. Fedőlemez (280 × 125 mm). Mindkét hosszanti végére ragasszunk fel egy-egy csíkban ragasztószalagot (280 × 6 × 0,25 mm) (lásd az 1. ábrát).

5.4. Elektroforézises kamra hűtőlemezzel (pl. 265 × 125 mm) és megfelelő áramellátással (≥ 2,5 kV), vagy automata elektroforézises eszköz.

5.5. Cirkulációs kriosztát, termosztátos vezérléssel 12 ± 0,5 °C-on.

5.6. 3000 g-ig állítható centrifuga.

5.7. Elektródacsíkok (≥ 265 mm hosszban).

5.8. Műanyag csepegtetőpalackok az anód- és a katódoldat számára.

5.9. Mintafelvivő eszköz (10 × 5 mm, viszkózus vagy alacsony fehérjeadszorpciós szűrőpapír).

5.10. Rozsdamentes acélolló, szike és műszerészcsipesz.

5.11. Rozsdamentes acél vagy üvegfestő- és festékkivonó-edények (például 280 × 150 mm műszertálca).

5.12. Szabályozható rúdhomogenizátor (10 mm tengelyátmérővel), percenkénti fordulatszám-tartomány 8000-20000 között.

5.13. Mágneses keverő.

5.14. Ultrahangos fürdő.

5.15. Filmhegesztő gép.

5.16. 25 μl-es mikropipetta.

5.17. Vákuumbepárló vagy fagyasztva-szárító.

5.18. Termosztatikus vezérlésű, 35 és 40 ± 1 °C-ra állítható vízfürdő rázógéppel.

5.19. Denzitométer, λ = 634 nm-es leolvasóval felszerelve.

6. Vizsgálati eljárás

6.1. A minta előkészítése

6.1.1. Kazeinek izolálása

Egy 100 milliliteres centrifugacsőbe mérjünk ki 5 g szárazanyag-mennyiségnek megfelelő sajtot vagy a referenciastandardot, adjunk hozzá 60 desztillált vizet és homogenizáljuk a rúdhomogenizátorral (8000-10000-es percenkénti fordulatszám között). Állítsuk be hígított ecetsavval (4.5.1.) 4,6 pH-ra, és centrifugáljuk (5 perc, 3000 g). A zsírt és a savót öntsük le, a maradékot pedig 20000-es percenkénti fordulatszámon homogenizáljuk el 40 ml desztillált vízben, amelynek a pH-ját előzetesen hígított ecetsavval (4.5.1.) 4,5 pH-ra állítottuk be, adjunk hozzá 20 ml diklórmetánt (4.5.2.), ismét homogenizáljuk és centrifugáljuk (5 perc, 3000 g). Egy spatulával távolítsuk el a kazeinréteget, amely a vizes és a szerves fázis között található (lásd a 2. ábrát), és dekantáljuk mindkét fázist. A kazeint ismét homogenizáljuk 40 ml desztillált vízben (a fentiek szerint) és 20 ml diklórmetánnal (4.5.2.) centrifugáljuk. Addig ismételjük ezt a műveletet, amíg mindkét extraháló fázis színtelen nem lesz (két-három alkalommal). A fehérjemaradékot 50 ml acetonban (4.53.) homogenizáljuk és egy közepes sebességű, redőzött papírszűrőn szűrjük át. A szűrőn maradt maradékot két, külön 25 ml-es adagban acetonnal mossuk le, hagyjuk a levegőn megszáradni, vagy nitrogénnel szárítsuk, majd törjük finom porrá egy mozsárban.

Megjegyzés:

A száraz kazeinizolátumokat -20 °C hőmérsékleten kell tartani.

6.1.2. A β-kazeinek plazminos emésztése a γ-kazeinek kifejezettebbé tétele érdekében

Oszlassunk el 25 mg izolált kazeint (6.1.1.) 0,5 ml ammónium-karbonát-pufferben (4.7.1.) és 20 percig homogenizáljuk, például ultrahangos kezeléssel. Melegítsük fel 40 °C-ra, és adjunk hozzá 10 μl plazmint (4.7.2.), keverjük össze, majd folyamatos rázatás mellett inkubáljuk egy órán át 40 °C-on. Az enzim késleltetése érdekében adjunk hozzá 20 μl ε-aminokapronsav oldatot (4.7.3.), majd 200 mg szilárd karbamidot és 2 mg ditio-treitolt.

Megjegyzés:

A futtatott kazeincsíkok nagyobb szimmetriájának elérése érdekében ajánlatos az oldatot a ε-aminokapronsav hozzáadását követően liofilizálni, majd a maradékot 0,5 ml proteinoldó-pufferben oldani (4.6.).

6.2. A karbamid tartalmú poliakrilamid-gél elkészítése

Néhány csepp víz segítségével terítsük ki a gélhordólemezt (5.2.) egy üveglapra (5.1.) egy papírtörölközővel vagy itatóssal eltávolítva a felesleges vizet. A fedőlemezt (5.3.) egy másik üveglapra terítsük ki a távtartókkal (0,25 mm) együtt azonos módon. Fektessük a lapot vízszintesen egy szintező asztalra.

Adjunk hozzá az előkészített és légmentesített géloldathoz (4.1.2.) 10 μl Temed-(4.1.3.1.) oldatot, keverjük össze és adjunk még hozzá 10 μl PER-oldatot (4.1.3.2.), ezt is alaposan keverjük össze, majd azonnal öntsük ki egyenletesen a fedőlemez közepére. A gélhordozólemez egyik szélét arccal lefelé fektessük a fedőlemez mellé, és lassan engedjük rá úgy, hogy a két lemez között egy gélfilm képződjön, amely egyenletesen és buborékmentesen kitölti a helyet (3. ábra). Egy vékony spatula segítségével gondosan, egészen engedjük le a gélhordozólemezt, és helyezzünk súlyként még három üveglemezt a tetejére. Miután a polimerizáció befejeződött (mintegy 60 perc elteltével), a polimerizálódott gélt az üveglemezek felfordításával emeljük át a hordozólemezről a fedőlemezre. A hordozólemez alsó felét gondosan tisztítsuk meg a maradványok és a karbamid eltávolítása érdekében. A gélszendvicset hegesszük bele egy filmcsőbe, és tároljuk hűtőszekrényben (legfeljebb hat hétig).

Megjegyzés:

A fedőlemez a távtartókkal újra felhasználható. A poliakrilamid-gél kisebb darabokra is felvágható, amely akkor ajánlott, ha kevesebb minta áll rendelkezésünkre, vagy egy automatikus elektroforézis készüléket használunk (két gél, 4,5 × 5 cm méretben).

6.3. Izoelektromos futtatás

A hűtőtermosztátot állítsuk be 12 °C-ra. A gélhordólemez hátulját petróleummal töröljük le, majd cseppentsünk néhány csepp petróleumot (4.2.) a hűtőblokk közepére. Ezután a gélszendvicset terítsük rá hordozó felülettel lefelé, óvatosan ügyelve arra, hogy ne képződjenek levegőbuborékok. Töröljünk le minden felesleges petróleumot, és távolítsuk el a fedőlemezt. Az elektródcsíkokat áztassuk bele az elektródos oldatokba (4.3., 4.4.), vágjuk le a gél hosszára és fektessük le a megadott helyzetbe (az elektródok távolsága 9,5 cm).

Az izoelektromos futtatás feltételei:

6.3.1. Gélméret 265 × 125 × 0,25 mm

Megjegyzés:

Ha a gél vastagságát vagy szélességét megváltoztatjuk, az áramerősség és a teljesítmény értékeit megfelelő módon kell módosítani (például kettőzzük meg az áramerősség és teljesítmény értékeit, ha 265 × 125 × 0,5 mm-es gélt használunk).

6.3.2. A következőkben egy automatikus elektroforéziskészülék feszültségprogramja látható (2 db 5,0 × 4,5 cm gél), az elektródokat csíkok nélkül, azonnal a gélre helyezzük fel.

1. Előfuttatás | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |

2. A minta futtatása | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |

3. Futtatás | 1200 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 80 Vh |

4. Futtatás | 1500 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |

A mintafelvivőt a 2. lépésben 0 Vh-nál helyezzük el.

A mintafelvivőt a 2. lépésben 30 Vh-nál távolítsuk el.

6.4. Fehérjefestés

6.4.1. Fehérjefixálás

Az áram kikapcsolása után azonnal távolítsuk el az elektródcsíkokat, és a gélt rögtön tegyük a 200 ml fixálószerrel (4.9.) töltött festő/festékkivonó edénybe; folyamatos rázatás mellett hagyjuk benne 15 percig.

6.4.2. A géllemez mosása és festése

Alaposan öntsük le a fixálószert és a géllemezt kétszer harminc másodpercig mossuk le alkalmanként 100 ml festékkivonó szerben (4.10.). Öntsük le a kivonó oldatot és töltsük meg az edényt 250 ml festőoldattal (4.11.3.); 45 percig fessünk, miközben gyengén rázogatjuk az edényt.

6.4.3. Festék kivonása a géllemezből

Öntsük le a festőoldatot, kétszer mossuk le alkalmanként 100 ml festékkivonó szerben (4.10.), majd rázzuk 15 percen át 200 ml festékkivonó szerben és ismételjük meg a festékkivonást legalább két-három alkalommal egészen addig, amíg a háttér tiszta és színtelen nem lesz. Ezt követően desztillált vízzel öblítsük le a géllemezt (2 × 2 perc), és levegőn (2-3 óra) vagy hajszárítóval (10-15 perc) szárítsuk meg.

1.megjegyzés:

A fixálást, mosást, festést és festékkivonást 20 °C-on végezzük. Ne használjunk magas hőmérsékletet.

2.megjegyzés:

Ha az érzékenyebb ezüstfestést (például a Pharmacia Biotech ezüstfestő fehérjekészlete, kódszáma 17-1150-01) választjuk, a plazminnal kezelt kazeinmintákat 5 mg/ml-re kell hígítani.

7. Értékelés

Az értékelést az ismeretlen minta által adott fehérjemintázatnak a referenciastandardból ugyanazon a gélen kapott mintázattal történő összehasonlítása révén végezhetjük el. A juh-, kecske- vagy bivalytejből, illetve juh-, kecske- vagy bivalytej keverékéből készített sajtokban található tehéntej kimutatása a γ3- és γ2-kazeinek révén történik, amelyek izoelektromos futtatási pontjai a 6,5-ös pH és 7,5-ös pH közötti tartományba esnek (4a., 4b. és 5. ábra). A kimutatási határ kisebb, mint 0,5 %.

7.1. Szemrevételezéssel történő értékelés

A szarvasmarha eredetű tej mennyiségének szemrevételezéssel történő értékeléséhez ajánlatos a minták és a standardok koncentrációit úgy beszabályozni, hogy ugyanolyan intenzitást kapjunk a juh, kecske, és/vagy bivaly eredetű γ2- és γ3-kazeinekre (lásd a "γ2 E,G,B" és "γ3 E,G,B"csíkokat a 4a., 4b. és 5. ábrán). Ezt követően az ismeretlen minta szarvasmarha eredetű tejtartalma (1 %-nál kevesebb, egyenlő vagy több) közvetlenül megítélhető, ha a szarvasmarha eredetű γ3- és γ2-kazeineket (lásd a "γ3 C" és "γ2 C" csíkot a 4a., 4b. és az 5. ábrán) egybevetjük a 0 % és az 1 %-os referenciastandardokkal (juh és kecske esetében), valamint a laboratórium belső standardjával (bivalynál).

7.2. Denzitometriás értékelés

Ha rendelkezésre áll, használjunk denzitométert (5.19.) a szarvasmarha eredetű és a juh, kecske, illetve bivaly eredetű γ3- és γ2-kazeinek adta csúcsok egymáshoz viszonyított arányának mérésére (lásd az 5. ábrát). Hasonlítsuk össze ezt az értéket az ugyanezen a gélen elemzett 1 %-os referenciastandard (juh, kecske), illetve a laboratóriumi belső standard (bivaly) γ3- és γ2-kazeincsúcsa által lefedett terület arányával.

Megjegyzés:

A módszer akkor működik megfelelően, ha mindkét szarvasmarha eredetű kazeinre, a γ3- és γ2-kazeinekre egyértelműen pozitív a jelzés az 1 %-os referenciastandardban, de nincs jel a 0 %-os standardban. Ellenkező esetben, az eljárást optimalizálni kell a módszer részletes leírását követve.

A mintát akkor fogjuk pozitívnak tekinteni, ha benne a szarvasmarha eredetű γ3- és γ2-kazein, illetve az ezeknek megfelelő csúcsok alatti terület nagysága nagyobb vagy egyenlő az 1 %-os referenciastandardnál kapott szintnél.

8. Hivatkozások

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B.J.Radola,ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1. 43-56 (1980).

+++++ TIFF +++++

[1] Az Ampholine® pH 3,5-9,5-es (Pharmacia) és a Resolyte® pH 5-7, valamint pH 6-8-as (BDH, Merck) termékek különösen alkalmasnak bizonyultak a γ -kazeinek kívánt szeparációjának elérésére.

[2] Az Ampholine® pH 3,5-9,5-es (Pharmacia) és a Resolyte® pH 5-7, valamint pH 6-8-as (BDH, Merck) termékek különösen alkalmasnak bizonyultak a γ -kazeinek kívánt szeparációjának elérésére.

[3] Az Ampholine® pH 3,5-9,5-es (Pharmacia) és a Resolyte® pH 5-7, valamint pH 6-8-as (BDH, Merck) termékek különösen alkalmasnak bizonyultak a γ -kazeinek kívánt szeparációjának elérésére.

[4] Mintaalkalmazás: Az előzetes futtatást követően (1. lépés) pipettázzunk 18 μl mintát és standardoldatokat a mintafelvivőre (10 × 5 mm), azokat egymástól legalább 1 mm-es távolságra, az anódtól pedig hosszirányban legalább 5 mm-re helyezzük rá a gélre és enyhén nyomjuk meg. A fenti körülmények mellett végezzük el a futtatást és óvatosan távolítsuk el a mintafelvivő eszközt a minta 60 perces futtatását követően.

--------------------------------------------------

XVI. MELLÉKLET

(11. cikk)

REFERENCIAMÓDSZER KÓLIBAKTÉRIUMOK KIMUTATÁSÁRA VAJBAN, SOVÁNY TEJPORBAN, KAZEINBEN ÉS KAZEINÁTOKBAN

A táptalajt 1 g vajnak megfelelő mintákkal oltunk be, ha a kólibaktériumok jelenlétére vonatkozóan vajat vizsgálunk.

Amennyiben sovány tejport, kazeint vagy kazeinátokat vizsgálunk kólibaktériumok jelenlétére vonatkozóan, 0,1 g-os mintákat kell a táptalajra oltani.

A 73A: 1985 IDF-szabvány B módszerét a következő módosításokkal kell alkalmazni:

1. A minták előkészítését a 122B:1992 IDF-szabvány szerint kell végezni. Savkazein esetében tetszés szerint alkalmazható a 73A:1985 IDF-szabványban meghatározott minta előkészítési eljárás is.

2. Csak 1 g-os mintával (vaj esetében) vagy 0,1 g-os mintákkal (sovány tejpor, kazein/kazeinátok esetében) beoltott kémcsöveket használunk inkubálásra és értékelésre. Nem készítünk hígítási sort.

Az eredmények értékelése

Három negatív eredmény: | A követelmény teljesült |

Két vagy három pozitív eredmény: | A követelmény nem teljesült |

Két negatív eredmény: | Két további mintát kell megvizsgálni, amelyek - vaj esetében - 1 g-osak, illetve - sovány tejpor, kazein/kazeinátok esetében - 0,1 g-osak lehetnek. Ha a két utolsó eredmény negatív, a követelmény teljesült, ellenkező esetben a követelmény nem teljesült. |

Észrevétel

Kólibaktérium-tartalom: átlagosan 1/10 g vajnál; 1/g sovány tejpor, kazein/kazeinátok esetében.

A követelmény teljesülését jelző eredményeket 93 %-os valószínűséggel kapjuk.

Kólibaktérium-tartalom: átlagosan 1/g vajnál; 1/0,1 g sovány tejpor, kazein/kazeinátok esetében.

A követelmény nem teljesülését jelző eredményeket 91 %-os valószínűséggel kapjuk.

(Feltételezés: Poisson-eloszlás).

--------------------------------------------------

XVII. MELLÉKLET

(12. cikk)

MÓDSZER A 2309 KN-KÓD [1] ALÁ TARTOZÓ TERMÉKEK TEJCUKORTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSÁRA

I. RÉSZ

1. Alkalmazási terület

A módszert olyan esetekben kell alkalmazni, amikor a tejcukortartalom meghaladja a 0,5 %-ot.

2. A módszer elve

Oldjuk fel a cukrot vízben. Engedjük, hogy az élesztő (Saccharomyces cerevisiae) kifejtse hatását, ez a tejcukrot érintetlenül hagyja. Tisztítást és szűrést követően a Luff-Schoorl-módszerrel határozzuk meg ennek az oldatnak a tejcukortartalmát.

3. Vegyszerek

Nátrium-tioszulfát 0,1 N

Indikátor: keményítőoldat. Adjunk hozzá egy liter forrásban lévő vízhez 5 g oldható keményítő (10 mg higanyjodidot is lehet belekeverni mint tartósítószer) és 30 ml víz keverékét; a keveréket forraljuk három percen keresztül, majd hagyjuk kihűlni.

Kálium-jodid oldat AR 30 %-os (w/v).

Kénsavoldat 6 N

Luff-Schoorl-reagens:

a) Oldjunk fel 25 g vasmentes réz-II-szulfát-pentahidrátot (CuSO45H2O) 100 ml vízben,

b) Oldjunk fel 50 g citromsav-monohidrátot (C6H8O7H2O) 50 ml vízben,

c) Oldjunk fel 143,8 g vízmentes nátriumkarbonátot (Na2CO2) mintegy 300 ml forró vízben és engedjük kihűlni.

A b) oldatot adjuk hozzá a c)-hez, gyengéden rázzuk, majd adjuk hozzá az a) oldatot. Egészítsük ki egy literre, hagyjuk állni egy éjszakára, majd szűrjük le. Ellenőrizzük az így nyert reagens normalitását (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). A pH-nak megközelítőleg 9,4-nek kell lennie.

Carrez I.-oldat: oldjunk fel 23,8 g Zn(C2H3O2)2.2H2O-t és 3 g jégecetet vízben és egészítsük ki 100 ml-re.

Carrez II.-oldat: oldjunk 10,6 g de K4F2(CN)6.3H2O-t vízben és egészítsük ki 100 ml-re.

Forrás közben sósavval kezelt, mosott és szárított horzsakődarabkák. Saccharomyces cerevisae-szuszpenzió: 25 g friss élesztő 100 ml vízben (hűtőszekrényben ne tartsuk egy hétnél tovább).

4. Vizsgálati eljárás

Az elemzéshez 1 milligrammos pontossággal mérjünk ki 1 grammot a mintából; ezt helyezzük egy kalibrált 100 ml-es lombikba. Adjunk hozzá 25-30 ml vizet. Helyezzük a lombikot 30 percre forrásban lévő vízfürdőbe, majd hűtsük vissza megközelítőleg 35 °C-ra.

Adjunk hozzá 5 ml-t az élesztőszuszpenzióból [2], és rázzuk össze. Hagyjuk a kalibrált lombikot és annak tartalmát két órán keresztül egy 38-40 °C-ra állított vízfürdőben.

Az erjedést követően hűtsük vissza az anyagot megközelítőleg 20 °C-ra. Adjunk hozzá 2,5 ml Carrez I.-oldatot és rázzuk harminc másodpercig; majd adjunk hozzá 2,5 ml Carrez II.-oldatot és ezt is rázzuk harminc másodpercig. Egészítsük ki vízzel 100 ml-re, keverjük el és szűrjük le. Pipettázzunk a szűrletből legfeljebb 25 ml-t, amely lehetőleg 40-80 mg mennyiségű tejcukrot tartalmaz; szükség esetén egészítsük ki vízzel 25 ml-re és a Luff-Schoorl-módszerrel határozzuk meg a vízmentes tejcukortartalmat.

Végezzünk teljes vakpróbát csak élesztővel.

II. RÉSZ

1. Tejcukortartalom meghatározása a Luff-Schoorl-módszerrel

Pipettázzunk 25 ml Luff-Schoorl-reagenst egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba; adjunk hozzá 25 ml pontosan kimért és feltisztult oldatot.

Két horzsakődarabka hozzáadása után a folyadékot átlagos magasságú nyílt láng felett melegítsük és kézzel rázogassuk, majd forraljuk megközelítőleg két percig. Azonnal helyezzük át az Erlenmeyer-lombikot egy azbeszt lángelosztóra, amely alatt a lángot előzetesen már meggyújtottuk. Ezt úgy szabályozzuk, hogy az Erlenmeyer-lombiknak csak az alját melegítse, majd illesszünk hozzá egy visszafolyó hűtőt. Ettől a pillanattól fogva pontosan tíz percen át forraljuk. Azonnal hűtsük le hideg vízben, és megközelítőleg öt perc elteltével a következők szerint vizsgáljuk meg:

Adjunk a folyadékhoz 10 ml kálium-jodidot, és ezután azonnal, óvatosan (mivel jelentős mértékű habosodás fordulhat elő) 25 ml 6 N kénsavat.

A nátrium-tioszulfáttal addig teszteljük, amíg tompa sárga szín nem jelenik meg, és a vizsgálat vége felé hozzáadjuk a keményítőindikátort.

Ugyanezt a vizsgálatot kell elvégezni, miután pontosan 25 ml Luff-Schoorl-reagens és 25 ml víz keverékéhez hozzáadtunk 10 ml kálium-jodidot és 25 ml 6 N kénsavat, ezúttal azonban anélkül, hogy forrásig hevítettük volna.

A következő táblázat alkalmazásával állapítsuk meg a két vizsgálat eredménye közötti különbségnek megfelelelő, milligrammokban kifejezett tejcukortartalmat (a 0,1 N töménységű nátrium-tioszulfát milliliterében kifejezve).

TÁBLÁZAT

Táblázat 25 ml de Luff-Schoorl-reagenshez

(a feltételeket lásd a szövegben)

1. Nátrium-tioszulfát 0,1 N

2. Tejcukor C12H22O11

1 | 2 |

ml | mg | Különbség |

1 | 3,6 | |

| | 3,7 |

2 | 7,3 | |

| | 3,7 |

3 | 11,0 | |

| | 3,7 |

4 | 14,7 | |

| | 3,7 |

5 | 18,4 | |

| | 3,7 |

6 | 22,1 | |

| | 3,7 |

7 | 25,8 | |

| | 3,7 |

8 | 29,5 | |

| | 3,7 |

9 | 33,2 | |

| | 3,8 |

10 | 37,0 | |

| | 3,8 |

11 | 40,8 | |

| | 3,8 |

12 | 44,6 | |

| | 3,8 |

13 | 48,4 | |

| | 3,8 |

14 | 52,2 | |

| | 3,8 |

15 | 56,0 | |

| | 3,9 |

16 | 59,9 | |

| | 3,9 |

17 | 63,8 | |

| | 3,9 |

18 | 67,7 | |

| | 4,0 |

19 | 71,7 | |

| | 4,0 |

20 | 75,7 | |

| | 4,1 |

21 | 79,8 | |

| | 4,1 |

22 | 83,9 | |

| | 4,1 |

23 | 88,0 | |

[1] 222/88/EGK rendelet

[2] A 40 %-nál több fermentálható cukrot tartalmazó termékeknél növeljük meg a szuszpenzió mennyiségét.

--------------------------------------------------

XVIII. MELLÉKLET

(13. cikk)

OLTÓSSAVÓ KIMUTATÁSA INTERVENCIÓS RAKTÁROZÁSRA SZÁNT SOVÁNY TEJPORBÓL A GLÜKOMAKROPEPTIDEK NAGY TELJESÍTMÉNYŰ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS ELJÁRÁSSAL (HPLC) VALÓ MEGHATÁROZÁSA ÚTJÁN

1. Tárgy és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az oltóssavó kimutatását intervenciós raktározásra szánt sovány tejporból a glükomakropeptidek meghatározása révén.

2. Hivatkozás

ISO 707 nemzetközi szabvány - Tej és tejtermékek - Mintavételi módszerek, az I. melléklet 2. c) pontjának utolsó bekezdésében foglalt irányelvek szerint.

3. Fogalommeghatározás

A sovány tejpor glükomakropeptid-tartalma: a következőkben bemutatott módszerrel meghatározott anyagtartalom tömegszázalékban kifejezve.

4. A módszer elve

- A sovány tejpor helyreállítása, zsír és fehérjék eltávolítása triklórecetsavas kicsapással és ezt követő centrifugálással,

- A glükomakropeptidek (GMP) mennyiségének meghatározása a felülúszóból nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC),

- A mintából kapott eredmények értékelése sovány tejporból és akár ismert mennyiségű savópor hozzáadásával, akár anélkül készült standardmintákkal való összehasonlítás révén.

5. Vegyszerek

Minden vegyszernek elismerten analitikai minőségűnek kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy azzal legalább egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie.

5.1. Triklór-ecetsav oldat

Oldjunk fel 240 g triklór-ecetsavat (Cl3CCOOH) vízben, és egészítsük ki vízzel 1000 ml-re.

5.2. Eluáló-oldat, 6,0 pH

Oldjunk fel 1,74 g kálium-hidrogénfoszfátot (K2HPO4), 12,37 g kálium-dihidrogénfoszfátot (KH2PO4), valamint 21,41 g nátrium-szulfátot (Na2SO4) megközelítőleg 700 ml vízben. Szükség esetén foszforsav vagy kálium-hidroxid felhasználásával állítsuk be a pH-ját 6,0-ra.

Egészítsük ki vízzel 1000 ml-re, és homogenizáljuk.

Szűrjük le az eluáló oldatot egy 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn.

5.3. Öblítőoldat

Keverjünk el egy rész acetonitrilt (CH3CN) kilenc rész vízzel. A keveréket szűrjük át egy 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn.

Megjegyzés:

Bármilyen más, csíraölő hatású öblítőoldat is alkalmazható, amely nem rontja az oszlopok felbontóképességét.

5.4. Standardminták

5.4.1. Az e rendeletben foglalt követelményeknek megfelelő sovány tejpor (azaz [0]).

5.4.2. Ugyanez a sovány tejpor 5 % (m/m) szabványos összetételű oltóssavó-porral hamisítva (azaz [5]).

6. Eszköz

6.1. Analitikai mérleg.

6.2. Olyan centrifuga, amely képes 2200 g centrifugális erő kifejtésére, és körülbelül 25 ml űrtartalmú lezárható centrifugacsövekkel van felszerelve.

6.3. Mechanikus rázógép.

6.4. Mágneses keverő.

6.5. Körülbelül 7 centiméter átmérőjű üvegtölcsérek.

6.6. Szűrőpapírok, közepes szűrőképességgel, körülbelül 12,5 cm átmérővel.

6.7. Üveg szűrőeszköz 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrővel.

6.8. Beosztással ellátott pipetták, amelyek alkalmasak 10 ml adagolására (ISO 648 A. osztály vagy ISO/R 835).

6.9. Termosztátos szabályozással ellátott vízfürdő 25 ± 0,5 °C-ra állítva.

6.10. HPLC-eszköz, részei:

6.10.1. Szivattyú.

6.10.2. Injektor, kézi vagy automata, 15-30 μl űrtartalommal.

6.10.3. Két sorosan kötött TSK 2000-SW kromatográfiás oszlop (30 cm hosszú, belső átmérő 0,75 cm) vagy ezzel egyenértékű oszlopok, és egy I 125-el vagy azzal egyenértékű anyaggal töltött előoszlop (3 cm×0,3 cm).

6.10.4. Termosztátos oszlopszárító, 35 ± 1 °C-ra állítva.

6.10.5. Változtatható hullámhosszúságú ultraibolya-sugárzás mérő, amely 205 nm-en 0,008 A-érzékenységű méréseket tesz lehetővé.

6.10.6. Völgytől-völgyig történő integrálásra alkalmas integrálógép.

Megjegyzés:

Lehetséges szobahőmérsékleten tartott oszlopokkal is dolgozni, de ekkor a felbontó képességük valamivel kisebb. Ebben az esetben, a hőmérséklet az elemzés egyik tartományában sem változhat ± 5 °C-nál többet.

7. Mintavétel

7.1. Az ISO 707 nemzetközi szabvány - "Tej és tejtermékek - Mintavételi módszerek", az I. melléklet 2. c) pontjának utolsó bekezdésében foglalt irányelvekkel összhangban.

7.2. Tároljuk a mintát olyan körülmények között, amely kizárja, hogy az összetétele megváltozzon vagy lebomoljon.

8. Vizsgálati eljárás

8.1. A vizsgálati minta előkészítése

A tejport tegyük a tejpor terjedelménél kétszer nagyobb űrtartalmú edénybe, amely légmentesen zárható. Azonnal zárjuk le az edényt. Az edény ismételt felfordításával alaposan keverjük fel a benne lévő tejport.

8.2. Vizsgálati anyag

Egy centrifugacsőbe (6.2.) mérjünk ki a mintából 2,000 + 0,001 g-ot.

8.3. Zsír és fehérje eltávolítása

8.3.1. Adjunk 20 g meleg vizet (50 °C) a vizsgálandó mennyiséghez. Oldjuk fel a port mechanikus rázógép segítségével öt perces rázatással (6.3.). Hűtsük le a csövet 25 °C-ra.

8.3.2. Adjunk hozzá két percen belül 10,0 ml triklór-ecetsav oldatot (5.1.), miközben a mágneses keverővel keverjük (6.4.). Helyezzük a csövet vízfürdőbe (6.9.), és hagyjuk ott 60 percig.

8.3.3. Centrifugáljuk (6.2.) 10 percig 2200 g-n, vagy szűrjük át a szűrőpapíron (6.6.), félretéve az első 5 ml szűrletet.

8.4. Kromatográfiás meghatározás

8.4.1. Fecskendezzünk 15-30 mikroliter pontosan kimért felülúszót vagy szűrletet (8.3.3.) a HPLC-készülékbe (6.10.), amelynek percenként 1,0 ml eluáló oldat (5.2.) áramlási sebességgel kell működnie.

Megjegyzés:

1. Az eluáló oldatot (5.2.) a kromatográfiás elemzés egész időtartama alatt tartsuk 85 °C-on, hogy gázmentes maradjon, és megakadályozzuk a mikroorganizmusok szaporodását. Más, hasonló eredményre vezető, elővigyázatossági intézkedés is alkalmazható.

2. Minden megszakítás alkalmával öblítsük át vízzel az oszlopokat. Soha ne hagyjuk bennük az eluálószert (5.2.).

Mielőtt 24 óránál hosszabb időre megszakítanánk a vizsgálatot, előbb öblítsük át az oszlopokat vízzel, majd mossuk legalább három órán át az 5.3 pontban meghatározott öblítő oldattal percenként 0,2 ml-es folyási sebesség mellett.

8.4.2. A vizsgálati minta [E] kromatográfiás elemzésének eredményét egy kromatogram formájában kapjuk meg, ahol minden csúcsot a rá jellemző retenciós idő (RT) alapján tudunk azonosítani a következők szerint:

II. csúcs: | A kromatogram második csúcsa, amelynek retenciós ideje körülbelül 12,5 perc. |

III. csúcs: | A kromatogram harmadik, a GMP-nek megfelelő csúcsa, amelynek retenciós ideje körülbelül 15,5 ± 1,0 perc. |

IV. csúcs: | A kromatogram negyedik csúcsa, amelynek retenciós ideje körülbelül 17,5 perc. |

Az oszlopok minősége befolyásolhatja az egyes csúcsok retenciós idejét.

Az integrátor (6.10.6.) minden csúcsra automatikusan kiszámolja a görbe alatti A területet:

AII: | II. csúcs alatti terület, |

AIII: | III. csúcs alatti terület, |

AIV: | IV. csúcs alatti terület. |

Lényeges, hogy még a mennyiségi értelmezés előtt minden kromatogram külalakját megvizsgáljuk, hogy felfedezzünk minden olyan rendellenességet, amely vagy a készülék vagy az oszlopok hibás működéséből ered, vagy a minta eredetére és jellegére vezethető vissza.

Kétség esetén az elemzést meg kell ismételni.

8.5. Kalibrálás

8.5.1. A standardmintára (5.4.) is alkalmazzuk pontosan ugyanazt az eljárást, mint amely a 8.2. és a 8.4.2. pont közötti leírásban szerepel.

Használjunk frissen készített oldatokat, mert a GMP 8 %-os triklórecetsavas környezetben hamar bomlik. A veszteség becsült értéke 30 °C-on óránként 0,2 %.

8.5.2. A minták kromatográfiás vizsgálatát megelőzően az oszlopokat az oldatban (8.5.1.) lévő standardminta (5.4.2.) ismételt befecskendezésével addig kondicionáljuk, amíg a GMP-nek megfelelő csúcs retenciós ideje konstanssá nem válik.

8.5.3. Ugyanannyi mennyiségű szűrletnek (8.5.1.) az injektálásával, mint amennyit a mintáknál használtunk, határozzuk meg az R-választényezőket.

9. Az eredmények kifejezése

9.1. A számítás módja és a képletek

9.1.1. Az R-választényezők kiszámítása:

A II. csúcsra: | RII=100AII0 |

A IV. csúcsra: | RIV=100AIV0 |

ahol:

RII és RIV = a II., illetve IV. csúcs választényezője,

AII [0] és AIV = a standardminta [0] esetén a 8.5.3. pontban nyert II., illetve IV. csúcs alatti terület.

A III. csúcsra: | RIII=WAIII5- AIII0 |

ahol:

RIII = a III. csúcs választényezője,

AIII [0] és AIII = a [0], illetve [5] standardminták esetén a 8.5.3. pontban nyert III. csúcs alatti területek

W = a savó mennyisége a standardmintában [5], azaz 5.

9.1.2. A csúcsok alatti relatív terület a mintában [E]

= R

×A

IIE

III

= R

×A

IVE

ahol:

SII[E], SIII[E], SIV[E] = a II., III. és IV. csúcs alatti relatív területek a mintában [E],

AII[E], AIII[E], AIV[E] = a 8.4.2. pont szerint nyert II., III. és IV. csúcs alatti területek a mintában [E],

RII, RIII, RIV = a 9.1.1. pontban számított választényezők.

9.1.3. A mintából [E] kapott III. csúcs relatív retenciós idejének kiszámítása:

RRT

III5

ahol:

RRTIII [E] = a minta [E] III. csúcsának relatív retenciós ideje,

RTIII [E] = a mintából [E] a 8.4.2. pont szerint nyert III. csúcs retenciós ideje,

RTIII [5] = a kontrollmintából [5] a 8.5.3. pont szerint nyert III. csúcs retenciós ideje.

9.1.4. A kísérletek azt mutatták ki, hogy a III. csúcs relatív retenciós ideje, vagyis RRTIII [E] és a hozzáadott savópor mennyisége között 10 %-ig lineáris összefüggés van.

- Az RRTIII [E] < 1,000, ha a savótartalom > 5 %,

- Az RRTIII [E] ≥ 1,000, ha a savótartalom ≤ 5 %.

Az RRTIII értékeire megengedhető bizonytalansági tényező ± 0,002.

Rendes esetben az RRTIII [0] értéke 1,034-től csak kis mértékben tér el. Az oszlopok állapotától függően az érték közeledhet az 1,000-hez, de annál mindig nagyobbnak kell lennie.

9.2. A mintában található oltóssavópor százalékos mennyiségének kiszámítása:

W = S

- 0,9

ahol:

W = az oltóssavó m/m százaléka a mintában [E];

SIII [E] = az [E] minta III. csúcsának a 9.1.2. pontban kapott relatív területe;

1,3 = a III. csúcs átlagos relatív területe 100 gramm meg nem hamisított, különböző eredetű sovány tejporra számított oltóssavó grammjában kifejezve. Ezt a számot kísérleti úton határozták meg;

SIII [0] = a III. csúcs relatív területe, amely RIII × AIII [0]-val egyenlő. Ezeket az értékeket a 9.1.1. illetve a 8.5.3. pontban kapjuk meg;

(SIII [0] - 0.9) = az 1,3-as átlagos relatív görbe alatti területre végzett korrekciót jelenti olyankor, amikor SIII [0] nem egyenlő 0,9-el. Kísérleti úton a kontrollminta [0] III. csúcsa alatti relatív átlagos terület 0,9.

9.3. Az eljárás pontossága

9.3.1. Ismételhetőség

Az egyidejűleg vagy rövid időeltéréssel egymás után ugyanazon személy által, ugyanazzal az eszközzel, azonos vizsgálati anyagon végzett két meghatározás eredményének különbsége ne haladja meg a 0,2 % m/m értéket.

9.3.2. Reprodukálhatóság

A két különböző laboratóriumban, azonos vizsgálati anyagon kapott két egyedi, egymástól független eredmény különbsége ne haladja meg a 0,4 % m/m értéket.

9.4. Értelmezés

9.4.1. Feltételezzük a savó hiányát a mintában, ha a SIII [E] III. csúcsának a termék 100 grammjára jutó oltóssavó grammban kifejezett relatív területe ≤

2,0 +

ahol:

2.0 = a III. csúcs relatív területére megengedhető legnagyobb érték, figyelembe véve a III. csúcsra vonatkozó relatív területet, azaz 1,3-at, a sovány tejpor változó összetétele miatti bizonytalanságot és a módszer reprodukálhatóságát (9.3.2.),

S III [0] - 0.9 = (SIIIaz elvégzendő korrekció akkor, ha a SIII [0] terület nem egyenlő 0,9-el (lásd a 9.2. pontot).

9.4.2. Ha a III. csúcs,

relatív területe > 2,0 +

és a II. csúcs, SII [E] relatív területe ≤ 160, az oltóssavó-tartalmat a 9.2. pontban jelzett módon határozzuk meg.

9.4.3. Ha a III. csúcs,

relatív területe > 2,0 +

és a II. csúcs, SII [E] relatív területe ≤ 160, határozzuk meg előbb a teljes fehérjetartalmat (P %), majd vizsgáljuk meg az 1. és 2. grafikont.

9.4.3.1. A magas fehérjetartalommal rendelkező, hamisítás nélküli sovány tejpor mintáinak elemzésével nyert adatok összeállítását az 1. és 2. grafikon mutatja.

A folyamatos vonal lineáris regressziót jelent, amelynek együtthatóit a legkisebb négyzetek módszerével számították ki.

A szaggatott egyenes vonal a III. csúcs relatív területének felső határát az esetek 90 %-ában meg nem haladott valószínűséggel rögzíti.

Az 1. és 2. grafikon szaggatott egyenes vonalainak egyenletei a következők:

SIII= 0,376 P % - 10,7 | (1. grafikon), |

SIII= 0,0123 SIIE + 0,93 | (2. grafikon), |

ahol:

SIII a III. csúcsra akár az összes fehérjetartalom alapján, akár az SII [E] csúcs relatív területének megfelelően számított relatív terület,

P % a tömegszázalékban kifejezett összes fehérjetartalom,

SII [E]. a minta 9.1.2. pontban számított relatív területe.

Ezek az egyenletek a 9.2. pontban említett 1,3-as számmal egyenértékűek.

A kapott SIII [E] relatív területe és az SIII relatív területe közötti különbség (T1 és T2) a következők szerint adódik:

= S

- 0,9

= S

0,0123 S

+ 0,93

- 0,9

9.4.3.2. Ha T1 és/vagy T2 nulla vagy annál kisebb, oltóssavó jelenlétét nem lehet kimutatni.

Ha T1 és T2 nullánál nagyobb, oltóssavó van jelen.

Az oltóssavó mennyiségét a következő képlet alapján számíthatjuk ki:

W = T

+ 0,91

ahol:

a szaggatott és folyamatos vonal között a függőleges tengelyen mért távolság.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

XIX. MELLÉKLET

(13. cikk)

OLTÓSSAVÓ-SZÁRAZANYAG MEGHATÁROZÁSA SOVÁNY TEJPORBAN ÉS A 2799/1999/EK RENDELETBEN EMLÍTETT KEVERÉKEKBEN

1. Cél: Oltóssavó-szárazanyag hozzáadásának kimutatása:

a) a 2799/1999/EK rendelet 2. cikkében meghatározott sovány tejporból; és

b) a 2799/1999/EK rendelet 4. cikkében meghatározott keverékekből.

2. Hivatkozások: ISO 707 nemzetközi szabvány

3. Fogalommeghatározás

Az oltóssavószárazanyag-tartalom a megadott eljárás alapján meghatározott, tömegszázalékban kifejezett mennyiség.

4. A módszer elve

A glükomakropeptid-A-tartalmat a XVIII. melléklet szerint határozzuk meg. A pozitív eredményt mutató mintákat fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) vizsgáljuk meg glükomakropeptid-A jelenlétére. A mintából kapott eredmények értékelése standardmintákkal való összehasonlítás révén történik, amelyek sovány tejporból, ismert mennyiségű savópor hozzáadásával, vagy anélkül készülnek. Az 1 % (m/m)-nál magasabb eredmények azt mutatják, hogy oltóssavó-szárazanyag van jelen.

5. Vegyszerek

Minden vegyszernek elismerten analitikai minőségűnek kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy azzal legalább egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie. Az acetonitrilnek spektroszkóposnak vagy HPLC-minőségűnek kell lennie. Az eljáráshoz szükséges vegyszerek leírását ennek a rendeletnek a XVIII. melléklete tartalmazza.

Vegyszerek fordított fázisú HPLC-hez.

Triklór-ecetsav oldat

5.1. Oldjunk fel 240 g triklór-ecetsavat (CCl3CCOOH) vízben, és egészítsük ki vízzel 1000 ml-re.

A- és B-eluens

5.2. A-oldat: Helyezzünk 150 ml acetonitrilt (CH3KN), 20 ml izopropanolt (CH3CHOHCH3), és 1,00 ml trifluor-ecetsavat (TFA, CF3COOH) egy 1000 ml-es térfogatmérő lombikba. Egészítsük ki vízzel 1000 ml-re.

B-oldat: Helyezzünk 550 ml acetonitrilt, 20 ml izopropanolt és 1,00 ml TFA-t egy 1000 ml-es térfogatmérő lombikba. Egészítsük ki vízzel 1000 ml-re. Használat előtt egy 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn szűrjük át az eluálószert.

5.3. Az oszlop konzerválása

Használatot követően az oszlopot a B-eluáló oldattal egy gradiens szerint át kell mosni és ezt követően acetonitrillel elöblíteni (egy gradiens szerint, 30 percig). Az oszlopot acetonitrilben kell tárolni.

5.4. Standarminták

5.4.1. Az intervenciós raktározás követelményeinek megfelelő sovány tejpor (azaz [0]).

5.4.2. Ugyanez a sovány tejpor 5 % (m/m) szabványos összetételű oltóssavóporral hamisítva (azaz [5]).

5.4.3. Ugyanez a sovány tejpor 50 % (m/m) szabványos összetételű oltóssavóporral hamisítva (azaz [50]) [1].

6. Eszközök

Az ehhez az eljáráshoz használatos eszközöket ennek a rendeletnek a XVIII. melléklete ismerteti.

6.1. Analitikai mérleg.

6.2. Olyan centrifuga, amely képes 2200 g centrifugális erő kifejtésére és körülbelül 50 ml űrtartalmú lezárható centrifugacsövekkel van felszerelve.

6.3. Mechanikus rázógép, amely 50 °C-on is működik.

6.4. Mágneses keverő.

6.5. Körülbelül hét centiméter átmérőjű üvegtölcsérek.

6.6. Szűrőpapírok, közepes szűrőképességgel, körülbelül 12,5 cm átmérővel.

6.7. Üveg szűrőeszköz 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrővel.

6.8. Beosztással ellátott pipetták, amelyek alkalmasak 10 ml adagolására (ISO 648, A osztály vagy ISO/R 835), vagy olyan rendszer, amely két perc alatt képes 10,0 ml adagolására.

6.9. Termosztátos szabályozással ellátott vízfürdő 25 ± 0,5 °C-re állítva.

6.10. HPLC-eszköz, részei:

6.10.1. Bináris gradiensű szivattyúrendszer.

6.10.2. Injektor, kézi vagy automata, 100 μl űrtartalommal.

6.10.3. Dupont Protein Plus kromatográfiás oszlop (25 cm hosszú, belső átmérő 0,46 cm) vagy ezzel egyenértékű, széles pórusú, szilika alapú fordított fázisú oszlop

6.10.4. Termosztátos oszlopszárító, 35 ± 1 °C-ra állítva.

6.10.5. Változtatható hullámhosszúságú UV-mérő, amely 210 nm-en (szükség esetén magasabb hullámhosszon is, 220 nm-ig) 0,02 Å érzékenységű méréseket tesz lehetővé.

6.10.6. Völgytől-völgyig történő integrálásra alkalmas integrálógép.

Megjegyzés:

Lehetséges szobahőmérsékleten tartott oszlopokkal is dolgozni, de ekkor a hőmérséklet az elemzés során sem változhat ± 1 °C-nál többet, ellenkező esetben túl nagy lesz a GMPÅ retenciós idejében fellépő variancia.

7. Mintavétel

7.1. A mintákat az ISO 707 nemzetközi szabványban meghatározottak szerint kell venni. A tagállamok azonban alkalmazhatnak ettől eltérő mintavételi módszert is, feltéve, ha az teljesíti a fent említett szabványban foglalt alapelveket.

7.2. Tároljuk a mintát olyan körülmények között, amely kizárja, hogy az összetétele megváltozzon vagy lebomoljon.

8. Vizsgálati eljárás

8.1. A vizsgálati minta előkészítése

8.2. Vizsgálati anyag

Egy centrifugacsőbe (6.2.) vagy 50 ml-es ledugaszolt lombikba mérjünk ki a mintából 2,00 ± 0,001 g-ot.

8.3. Zsír és fehérje eltávolítása

8.3.1. Adjunk 20 g meleg vizet (50 °C) a vizsgálandó mennyiséghez. Oldjuk fel a port öt perces rázatással, vagy savanyú író esetében harminc perces rázatással mechanikus rázógépen (6.3.). Helyezzük a centrifugacsövet vízfürdőbe (6.9.), és engedjük 25 °C-ra hűlni.

8.3.2. Adjunk hozzá két percen át 10,0 ml triklór-ecetsav oldatot (5.1.) 25 °C-on, miközben a mágneses keverőn keverjük (6.4.). Helyezzük a csövet vízfürdőbe (6.9.), és hagyjuk ott 60 percig.

8.3.3. Centrifugáljuk (6.2.) 10 percig 2200 g-on, vagy szűrjük át szűrőpapíron (6.6.). Öntsük el az első 5 ml szűrletet.

8.4. Kromatográfiás meghatározás

8.4.1. A HPLC-elemzést a XVIII. mellékletben leírtak szerint végezzük el. Ha negatív eredményt kapunk, az elemzett minta nem tartalmaz kimutatható mennyiségű oltóssavó-szárazanyagot. Ha az eredmény pozitív, a következőkben meghatározott fordított fázisú HPLC-eljárást kell alkalmazni. Savanyú írópor jelenléte hamis pozitív eredményt adhat. A fordított fázisú HPLC-eljárás kizárja ezt a lehetőséget.

8.4.2. Mielőtt végrehajtanánk a fordított fázisú HPLC-elemzést, a gradienskörülményeket optimalizálni kell. A körülbelül 6 ml holttérfogattal (a térfogat az oldatok összefutási pontjától az injektorhurok térfogatáig bezárólag) rendelkező gradiensrendszerekhez 26 ± 2 perces GMPA-retenciós idő az ideális. Az ennél kisebb holttérfogattal rendelkező gradiensrendszerek (például 2 ml) optimális retenciós időnek 22 percet használjanak.

Vegyük az 50 % oltóssavót tartalmazó, illetve nem tartalmazó standard mintákat (5.4.).

Injektáljunk 100 μl felülúszót vagy szűrletet (8.3.3.) a HPLC-készülékbe, amely a 1. táblázat szerint megadott felderítő gradienskörülmények között működik.

1. táblázat

Felderítő gradienskörülmények a kromatográfiás vizsgálatok optimalizálásához

Kiindulás | 1,0 | 90 | 10 | * |

27 | 1,0 | 60 | 40 | lineáris |

32 | 1,0 | 10 | 90 | lineáris |

37 | 1,0 | 10 | 90 | lineáris |

42 | 1,0 | 90 | 10 | lineáris |

A két kromatogram egybevetésének le kell fednie a GMPΑ-csúcs helyét.

A következőkben meghatározott képlet alkalmazásával kiszámítható, hogy milyen kiindulási oldószer-összetételt kell alkalmazni a normál gradienshez (lásd 8.4.3.):

% B = 10 - 2,5 +

* 30/27

% B = 7,5 +

* 1,11

ahol:

RTgmpA : a GMPΑ retenciós ideje a felderítő gradiensben

10 : a felderítő gradiens kiindulási % B-je

2,5 : a % B a középpontnál mínusz a % B a kiinduláskor a normál gradiensben

13,5 : a felderítő gradiens középponti ideje

26 : a GMPΑ által igényelt retenciós idő

6 : a felderítő és a normál gradiens meredekségének aránya

30 : a % B kiinduláskor mínusz a % B 27 percnél a felderítő gradiensben

27 : a felderítő gradiens futtatási ideje.

8.4.3. Vegyünk oldatot a vizsgálati mintákból

Fecskendezzünk 100 μl pontosan kimért felülúszót vagy szűrletet (8.3.3.) a percenként 1,0 ml eluáló oldat (5.2.) áramlási sebességgel üzemelő HPLC-készülékbe.

Az elemzés kezdetén az eluálószer összetételét a 8.4.2. pont adja meg. Ez rendszerint közelíti az A:B = 76:24 arányt (5.2.). Közvetlenül az injektálás után egy lineáris gradiens indul, amely 27 perc elteltével a B-oldat 5 %-kal magasabb százalékos arányát eredményezi. Ezután elindul egy lineáris gradiens, amely az eluálószer összetételét öt perc múlva 90 % B arányra alakítja. Ez az összetétel öt percen keresztül fennmarad, ezt követően egy lineáris gradiens mentén öt perc alatt a kiindulási összetételre változik. A szivattyúrendszer belső térfogatától függően a következő inkjektálást az eredeti állapot visszaállása után 15 perccel lehet elvégezni.

Észrevételek

1. A glükomakropeptidek visszatartási idejének 26 ± 2 percnek kell lennie. Ezt az első gradiens kiindulási és végponti feltételeinek változtatásával lehet elérni. Mindazonáltal a % B különbségének a kiindulási és végponti körülmények között az első gradiensben 5 % B maradjon.

2. Az eluálószereknek kellőképpen gázmenteseknek kell lenniük és így is kell maradniuk. Ez létfontosságú a gradiens-szivattyúrendszer megfelelő működéséhez. A GMP-csúcs retenciós idejének szórása kisebb kell legyen 0,1 percnél (n = 10).

3. Minden öt minta után ismét a referenciamintát (5.) kell beinjektálni, és segítségével új R-választényezőt kell meghatározni (9.1.1.).

8.4.4. A vizsgálati minta (E) kromatográfiás elemzésének eredményét egy kromatogram formájában kapjuk meg, ahol a GMP-csúcsot a körülbelül 26 perces retenciós idő alapján lehet beazonosítani.

Az integrátor (6.40.6.) automatikusan kiszámolja a GMP-csúcs H-csúcsmagasságát. Az alapvonal helyzetét minden kromatogramon ellenőrizni kell. Ha az alapvonal illesztése nem volt pontos, az elemzést vagy az integrálást ismételni kell.

Lényeges, hogy még a mennyiségi értelmezés előtt valamennyi kromatogram külalakját megvizsgáljuk, hogy felfedezzünk minden olyan rendellenességet, amely vagy a készülék vagy az oszlopok hibás működéséből ered, vagy a vizsgált minta eredetére és jellegére vezethető vissza. Kétség esetén az elemzést meg kell ismételni.

8.5. Kalibrálás

8.5.1. A standardmintákra (5.4.1. és 5.4.2.) is alkalmazzuk pontosan ugyanazt az eljárást, mint amely a 8.2. és 8.4.4. pont közötti leírásban szerepel. Használjunk frissen készített oldatokat, mert a GMP 8 %-os triklór-ecetsavas környezetben, szobahőmérsékleten hamar bomlik. Az oldat 4 oC-on 24 órán át stabil marad. Hosszú elemzési sorok esetében ajánlatos az automatikus injektorban hűtött mintatálcát használni.

Megjegyzés

A 8.4.2. pont kihagyható, ha a kiindulási feltételre korábbi elemzésekből ismert a % B értéke.

A referenciaminta (5.) kromatogramjának az 1. ábrával analógnak kell lennie. Ezen a görbén a GMPA-csúcsot két kisebb csúcs előzi meg. Lényeges ugyanilyen szeparációt elérni.

8.5.2. A minta kromatográfiás meghatározása előtt injektáljunk 100 μl oltóssavó nélküli standardmintát (0) (5.4.1.).

Ekkor a kromatogramon a GMPA-csúcs retenciós idejénél csúcs ne jelenjen meg.

8.5.3. Az R választényezőt úgy határozzuk meg, hogy a mintáknál használttal azonos mennyiségű szűrletet injektálunk (8.5.1.).

9. Az eredmények kifejezése

9.1. A számítás módszere és a képletek

9.1.1. Az R-választényező kiszámítása:

GMP-csúcs R = W/H

ahol

R = a GMP-csúcs választényezője

H = a GMP-csúcs magassága

W = a savó mennyisége a standardmintában (5.).

9.2. A mintában található oltóssavópor százalékos mennyiségének kiszámítása

W (E) = R × H (E)

ahol:

W(E) = az oltóssavó százalékos (m/m) mennyisége a mintában (E).

R = a GMP-csúcs választényezője (9.1.1.)

H(E) = a GMP-csúcs magassága a mintában (E).

Amennyiben W(E) nagyobb, mint 1 %, és a retenciós ideje, valamint a standardminta (5.) retenciós ideje közötti különbség kisebb, mint 0,2 perc, akkor oltóssavó-szárazanyag van jelen.

9.3. Az eljárás pontossága

9.3.1. Ismételhetőség

Az egyidőben vagy rövid időeltéréssel egymás után, ugyanazon laboratóriumi személyzet által, ugyanazzal az eszközzel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás különbsége nem haladhatja meg a 0,2 % m/m értéket.

9.3.2. Reprodukálhatóság

Még nincs meghatározva.

9.3.3. Linearitás

A 0-16 % oltóssavó-tartalom esetén lineáris összefüggést kell kapni, amelynek korrelációs együtthatója > 0,99.

9.4. Értelmezés

9.4.1. Úgy tekintjük, hogy savó van jelen, ha a 9.2. pontban kapott eredmény nagyobb, mint 1 % m/m és a GMP-csúcs retenciós ideje a standardmintáétól (5.) 0,2 percnél kisebb mértékben különbözik. Az 1 %-os határ összhangban van a 625/78/EGK rendelet V. mellékletének 9.2. és 9.4.1. pontjában foglalt rendelkezésekkel.

+++++ TIFF +++++

[1] Mind a szabványos összetételű oltóssavópor, mind a hamisított sovány tejpor beszerezhető a NIZO-nál, Kernhemseweg 2, Pf. 20 - NL-6710 BA Ede. Mindazonáltal a NIZO-porokkal azonos értékű eredményt adó egyéb porok is használhatók.

--------------------------------------------------

XX. MELLÉKLET

(14. cikk)

SOVÁNY TEJPOR: FOSZFATIDILSZERIN ÉS FOSZFATIDIL-ETANOLAMIN MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA

Fordított fázisú HPLC-módszer

1. Cél és alkalmazási terület

A módszer a foszfatidilszerin (PS) és a foszfatidil-etanolamin (PE) mennyiségi meghatározására szolgál sovány tejporból (SMP), és alkalmas a sovány tejporban található írószárazanyag kimutatására.

2. Fogalommeghatározás

PS + PE tartalom: az itt meghatározott eljárás alapján meghatározott anyag tömeghányada. Az eredményt 100 g porra megadott foszfatidil-etanolamin-dipalmitoil (PEDP) milligrammjában fejezzük ki.

3. A módszer elve

Aminofoszfolipidek kivonása tejporból készült tejből metil-alkohollal. A PS és a PE meghatározása fordított fázisú (RP) HPLC-vel és fluoreszcencia észleléssel o-ftáldialdehid (OPA) származék formájában történik. A vizsgálati minta PS- és PE-tartalmát egy ismert mennyiségű PEDP-t tartalmazó standarddal való összehasonlítás alapján kapjuk meg.

4. Reagensek

Az összes vegyszernek elismerten analitikai tisztaságúnak kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek, vagy azzal egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie.

4.1. Standardanyag: legalább 99 %-os tisztaságú PEDP

Megjegyzés:

A standardanyagot -18 °C-on kell tárolni.

4.2. A standardmintához és a vizsgálati minta előkészítéséhez használt vegyszerek

4.2.1. HPLC-minőségű metil-alkohol

4.2.2. HPLC-minőségű kloroform

4.2.3. Triptamin-monohidroklorid

4.3. Az o-ftáldialdehid derivátum készítéséhez használt vegyszerek

4.3.1. NaOH, 12 M vizes oldat

4.3.2. Bórsav, 0,4 M vizes oldat NaOH-val 10,0 pH-ra állítva (4.3.1.)

4.3.3. 2-merkapto-etanol

4.3.4. o-ftáldialdehid (OPA)

4.4. HPLC-eluáló oldatok

Az eluáló-oldatokat HPLC-minőségű vegyszerek felhasználásával kell készíteni

4.4.1. HPLC-minőségű víz

4.4.2. Fluorimetrikus tisztaságú metil-alkohol

4.4.3. Tetrahidrofurán

4.4.4. Nátrium-dihidrogén-foszfát

4.4.5. Nátrium-acetát

4.4.6. Ecetsav

5. Eszközök

5.1. Analitikai mérleg

5.2. Főzőpoharak, 25 és 100 ml űrtartalommal

5.3. 1 és 10 ml adagolására alkalmas pipetták

5.4. Mágneses keverő

5.5. 0,2; 0,5 és 5 ml-es beosztásos pipetták

5.6. 10; 50 és 100 ml űrtartalmú térfogatmérő lombikok

5.7. 20 és 100 μl-es fecskendők

5.8. Ultrahangos fürdő

5.9. 27000 × g-vel működő centrifuga

5.10. Mintegy 5 ml űrtartalmú üvegfiolák

5.11. 25 ml űrtartalmú beosztásos mérőhenger

5.12. pH-mérő

5.13. HPLC-eszköz

5.13.1. Gradiens-szivattyúrendszer, amely 200 bar-on 1,0 ml/min sebességgel tud működni

5.13.2. Automata mintavevő derivátumképző lehetőséggel

5.13.3. 30 °C-ra állított oszlopos szárító

5.13.4. Fluoreszcencia-detektor 330 ηm gerjesztési hullámhosszal és 440 ηm kibocsátási hullámhosszal

5.13.5. A görbe csúcsai alatti terület mérésére alkalmas integrálógép vagy adatfeldolgozó szoftver

5.13.6. Egy Lichrosphere - 100 oszlop (250 × 4,6 mm) vagy azzal egyenértékű oszlop, 5 μm-os részecske nagyságú oktadecilszilánnal (C18) töltve

6. Mintavétel

A mintavételt az 50B:1985 IDF-szabvány szerint kell elvégezni.

7. Vizsgálati eljárás

7.1. Belső mintaoldat készítése

Mérjünk ki egy 100 ml-es térfogatmérő lombikba (5.6.) 30,0 ± 0,1 mg triptamin-monokloridot (4.2.3.), és töltsük fel jelig metil-alkohollal (4.2.1). Pipettázzunk 1 ml-t (5.3.) ebből az oldatból egy 10 ml-es mérőlombikba (5.6.), és töltsük fel jelig metil-alkohollal (4.2.1.), hogy elérjük a 0,15 mM-triptaminkoncentrációt.

7.2. A vizsgálati minta oldatának elkészítése

Mérjünk ki egy 25 ml-es főzőpohárba (5.2.) 1,000 ± 0,001 g sovány tejpor mintát. Adjunk hozzá pipettával (5.3.) 10 ml 40 oC-os desztillált vizet, és a mágneses keverőn (5.4.) keverjük 30 percig, hogy minden csomó feloldódjon. Pipettázzunk 0,2 ml (5.5.) tejporból készült tejet egy 10 ml-es mérőlombikba (5.6.), majd a fecskendő használatával (5.7.) adjunk hozzá 100 μl 0,15 mM-os triptaminoldatot (7.1.), és töltsük fel metil-alkohollal a jelig (4.2.1.). Gondosan keverjük el felfordítással, és 15 percen át kezeljük ultrahanggal (5.8.). Centrifugáljuk (5.9.) 27000 × g erővel 10 percig, és a felülúszót egy üvegfiolába gyűjtsük össze (5.10.).

Megjegyzés:

A vizsgálati mintából készült oldatot a HPLC-elemzés elvégzéséig 4 oC-os hőmérsékleten kell tárolni.

7.3. Külső mintaoldat készítése

Mérjünk ki 55,4 mg PEDP-t (4.1.) egy 50 ml-es mérőlombikba (5.6.), és adjunk hozzá a beosztásos pipetta (5.11.) használatával 25 ml kloroformot (4.2.2). Melegítsük a ledugaszolt lombikot 50 °C-ra, és gondosan addig keverjük, míg a PEDP fel nem oldódik. Hűtsük vissza a lombikot 20 °C-ra, metil-alkohollal (4.2.1.) töltsük fel jelig, és felfordítással keverjük el. Pipettázzunk (5.3.) ebből az oldatból 1 ml-t egy 100 ml-es mérőlombikba (5.6.), majd jelig töltsük fel metil-alkohollal (4.2.1.). Pipettázzunk (5.3.) ebből az oldatból 1 ml-t egy 10 ml-es mérőlombikba (5.6.), adjunk hozzá 100 μl (5.7.) 0,15 mM-os triptaminoldatot (7.1.), majd jelig töltsük fel metil-alkohollal (4.2.1.). Keverjük fel felfordítással.

Megjegyzés:

A referenciaoldatot a HPLC-elemzés elvégzéséig 4 oC-os hőmérsékleten kell tárolni.

7.4. A deriváló reagens elkészítése

Mérjünk ki 25,0 ± 0,1 mg OPA-t (4.3.4.) egy 10 ml-es mérőlombikba (5.6.), adjunk hozzá 0,5 ml (5.5.) metanolt (4.2.1.), és gondosan keverjük el, hogy az OPA feloldódjon. Jelig töltsük fel bórsavoldattal (4.3.2.), és fecskendővel (5.7.) adjunk hozzá 20 μl 2-merkaptoetanolt (4.3.3.).

Megjegyzés:

A deriváló reagenst sötét fiolában 4 oC-on kell tárolni, körülbelül egy hétig stabil.

7.5. HPLC-meghatározás (futtatás)

7.5.1. Eluáló-oldatok (4.4.)

A-oldószer:

0,3 mM nátrium-dihidrogénfoszfát és 3 mM nátrium-acetát oldat (6,5-ös pH-ra ecetsavval beállítva): metil-alkohol: tetrahidrofurán = 558:440:2 (v/v/v) arányban

B-oldószer:

metil-alkohol

7.5.2. Javasolt eluáló gradiens:

Idő(perc) | A-oldószer(%) | B-oldószer(%) | Áramlási sebesség(ml/min) |

Indulás | 40 | 60 | 0 |

0,1 | 40 | 60 | 0,1 |

5,0 | 40 | 60 | 0,1 |

6,0 | 40 | 60 | 1,0 |

6,5 | 40 | 60 | 1,0 |

9,0 | 36 | 64 | 1,0 |

10,0 | 20 | 80 | 1,0 |

11,5 | 16 | 84 | 1,0 |

12,0 | 16 | 84 | 1,0 |

16,0 | 10 | 90 | 1,0 |

19,0 | 0 | 100 | 1,0 |

20,0 | 0 | 100 | 1,0 |

21,0 | 40 | 60 | 1,0 |

29,0 | 40 | 60 | 1,0 |

30,0 | 40 | 60 | 0 |

Megjegyzés:

Annak érdekében, hogy az 1. ábrán bemutatott felbontási képességet elérjük, az eluáló gradiens kismértékű megváltoztatására lehet szükség.

Oszlophőmérséklet: 30 oC.

7.5.3. Befecskendezett mennyiség: 50 μl deriválószer és 50 μl mintaoldat

7.5.4. Oszlop kalibrálása

A rendszer napi indításakor az oszlopot 100 %-os B-oldószerrel mossuk át egy negyed órán át, majd váltsunk át A:B = 40:60 arányú keverékre, és 1 ml/min áramlási sebességgel további negyedórán keresztül kalibráljuk. Végezzünk vak futtatást metil-alkohol injektálásával (4.2.1.)

Megjegyzés:

Hosszabb idejű tárolás előtt az oszlopot metil-alkohol: kloroform = 80:20 (v/v) arányú keverékével mossuk 30 percen át.

7.5.5. A PS + PE-tartalom meghatározása a vizsgálati mintában

7.5.6. Végezzük el a kromatográfiás elemzés lépéseit a futtatástól-futtatásig terjedő időt állandó értéken tartva, hogy konstans retenciós időket kapjunk. A választényező értékeléséhez a külső mintaoldatot (7.3.) minden 5-10 vizsgálati minta után fecskendezzük be.

Megjegyzés:

Az oszlopot a 100 %-os B-oldószerrel (7.5.1.) minden 20-25 futtatás után legalább harminc percen át kell mosnunk.

7.6. Integrálás módja

7.6.1. PEDP-csúcs

A PEDP egyetlen csúcsban jön le. A csúcs alatti területet völgytől-völgyig integrálással határozzuk meg.

7.6.2. Triptamincsúcs

A triptamin egyetlen csúcsban jön le (1. ábra). A csúcs alatti területet völgytől-völgyig integrálással határozzuk meg.

7.6.3. PS- és PE-csúcscsoportok

A leírt feltételek mellett (1. ábra) a PS két fő, részben egymástól el nem váló csúcsban eluálódik ki, amelyet egy kisebb csúcs előz meg. A PE három fő, részben egymástól el nem váló csúcsban eluálódik ki. Határozzuk meg minden csúcscsoport egész területét az alapvonalnak az 1. ábrán bemutatott illesztésével.

8. Számítás és az eredmények kifejezése

A vizsgálati minta PS- és PE-tartalmát a következők szerint lehet kiszámítani:

C = 55,36 x

T1T2

ahol:

C = a PS- vagy PE-tartalom a vizsgálati mintában (mg/100 g por)

1 = a standard mintaoldat PEDP-csúcsa alatti terület (7.3.)

2 = a PS- vagy PE-csúcs alatti terület a vizsgálati mintából készült oldatban (7.2.)

1 = a triptamincsúcs alatti terület a standard mintából készült oldatban (7.3.)

2 = a triptamincsúcs alatti terület a vizsgálati mintából készült oldatban (7.2.).

9. Pontosság

Megjegyzés:

Az ismételhetőségre vonatkozó értékek kiszámítása az IDF-szabványnak megfelelően történt [1]. Az ideiglenes reprodukálhatósági határérték kiszámítása az e rendelet III. mellékletének b) pontja szerint történt.

9.1. Ismételhetőség

Az ismételhetőség relatív szórása, amely az ugyanazon személy által, ugyanannak a készüléknek a használatával, ugyanolyan körülmények között, ugyanazon vizsgálati mintából, rövid időeltéréssel kapott független elemzési eredmények variabilitását fejezi ki, nem haladhatja meg a 2 %-os relatív értéket. Ha ilyen körülmények között végeznek el két meghatározást, akkor a két eredmény viszonylagos eltérése nem lehet nagyobb, mint az eredmények számtani középértékének 6 %-a.

9.2. Reprodukálhatóság

Ha két laboratóriumban más készülékeken, más személyek, más feltételek mellett végeznek el két meghatározást ugyanannak a vizsgálati mintának az elemzése céljából, akkor a két eredmény viszonylagos eltérése nem lehet nagyobb, mint az eredmények számtani középértékének 11 %-a.

10. Hivatkozások

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M.: "Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids." Sci. Tecn. Latt.-Cas. 39,395 (1988)

+++++ TIFF +++++

[1] 135B/1991 IDF-szabvány. Tej és tejtermékek. Analitikai módszerek pontossági jellemzői. Vázlat a kollaboratív vizsgálati eljáráshoz.

--------------------------------------------------

XXI. MELLÉKLET

(15. cikk)

ANTIBIOTIKUM ÉS SZULFONAMID/DAPSON MARADVÁNYOK KIMUTATÁSA SOVÁNY TEJPORBÓL

A baktériumgátlási szűrővizsgálat céljára a Bacillusstearothermophilus var. calidolactis C953-törzsét használjuk teszt-mikroorganizmusnak, amely eléggé érzékeny ahhoz, hogy kimutasson tejmintánként 4 μg benzilpenicillint és 100 μg szulfadimidint. A kereskedelemben kapható vizsgálati készletek is használhatók, ha rendelkeznek a kívánt benzilpencillin- és szulfadimidin-érzékenységgel [1].

A vizsgálatok céljára tejporból készített tejet használjunk (1 g por + 9 ml desztillált víz). A vizsgálatot a 258/1991. számú IDF-Bulletin, 2. fejezet, 1. szakaszában leírtak szerint, vagy a készlet gyártójának utasításait követve végezzük el.

A pozitív eredményeket a következő módon kell értelmezni:

1. Ismételjük meg a vizsgálatot pennicillinázt adva a kísérleti rendszerhez:

Pozitív eredmény: Ezzel az eljárással gátló anyag nem mutatható ki.

Negatív eredmény: A gátló anyag β-lactam típusú antibiotikum.

2. Ismételjük meg a vizsgálatot p-amino-benzoesavat adva a kísérleti rendszerhez:

Pozitív eredmény: Ezzel az eljárással gátló anyag nem mutatható ki.

Negatív eredmény: A gátló anyag valamilyen szulfonamid/dapson.

3. Ismételjük meg a vizsgálatot pennicillinázt + p-amino-benzoesavat adva a kísérleti rendszerhez:

Pozitív eredmény: Ezzel az eljárással gátló anyag nem mutatható ki.

Negatív eredmény: A gátló anyag β-lactam típusú antibiotikum és valamilyen szulfonamid/dapson.

[1] Fontos figyelmeztetés:Hamis pozitív eredményt kaphatunk, ha sovány tejpor elemzését végezzük. Ezért igen fontos róla meggyőződnünk róla, hogy a használt vizsgálati rendszer nem ad hamis pozitív eredményt.

--------------------------------------------------

XXII. MELLÉKLET

(16. cikk)

SOVÁNY TEJPOR MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA ÖSSZETETT TAKARMÁNYOKBAN A PARA-KAZEIN ENZIMES KICSAPÁSA ÚTJÁN

1. Cél

A sovány tejpor mennyiségének meghatározása összetett takarmányokban a para-kazein enzimes kicsapása útján.

2. Tárgy

Ez a módszer legalább 10 % sovány tejport tartalmazó összetett takarmányokra vonatkozik; nagy mennyiségű író és/vagy bizonyos nem tej eredetű fehérjék jelenléte interferenciához vezethet.

3. A módszer elve

3.1. Az összetett takarmányokban található kazein kioldása nátrium-citrát oldatos kivonással.

3.2. A kalciumion-koncentráció beállítása a kívánt szintre a para-kazein kicsapása érdekében; tejoltóenzim hozzáadásával a kazeinból para-kazein nyerhető.

3.3. A para-kazeines csapadék nitrogéntartalmát a 20A 1986 IDF-szabványban meghatározott Kjeldahl-módszerrel állapítjuk meg; a sovány tejpor mennyiségét a minimális 27,5 %-os kazeintartalom alapján lehet kiszámítani (lásd 9.1.).

4. Vegyszerek

Minden vegyszernek elismerten analitikai minőségűnek kell lennie. A felhasznált víznek desztillált víznek vagy azzal legalább egyenértékű tisztaságú víznek kell lennie. A tejoltóenzim kivételével (4.5.) az összes vegyszernek és oldatnak nitrogénmentesnek kell lennie.

4.1. Trinátrium-citrát, két kristályvízzel (1 % súly/térfogatszázalékos oldat).

4.2. Kalcium-klorid (2M-os oldat). Mérjünk ki egy megfelelő méretű porcelánedénybe (150-200 ml űrtartalmú) vagy egy főzőpohárba 20,018 g analitikai tisztaságú CaCO3-ot. Fedjük el desztillált vízzel, és tegyük be egy forrásban lévő vízfürdőbe. Lassan adjunk hozzá 50-60 ml HCl-oldatot (tömény sósav:víz = 1:1 arányú keveréke) a karbonát tökéletes oldatba viteléhez. A vízfürdőt hagyjuk forrásban egészen addig, amíg a CaCl2 ki nem szárad a reakcióba nem lépett sósav eltávolítása érdekében. Desztillált víz segítségével vigyük át egy 100 ml-es mérőlombikba, és hígítsuk fel a jelig. Mérjük meg a pH-értéket, amely nem lehet alacsonyabb, mint 4,0. Az oldatot hűtőszekrényben tároljuk.

4.3. 0,1 N nátrium-hidroxid.

4.4. 0,1 N sósav.

4.5. Folyékony borjúoltó (szabványos oltóerőssége1:10000). Hűtőszekrényben 4-6 °C között tartsuk.

4.6. A nitrogén mennyiségi meghatározásához használatos reagensek a 20A 1986 IDF-szabványban leírt Kjeldahl-módszer szerint.

5. Eszközök

Szokásos laboratóriumi eszközök, beleértve a következőket:

5.1. Dörzsmozsár vagy homogenizátor

5.2. Analitikai mérleg

5.3. Asztali centrifuga (2000 és 3000 közötti percenkénti fordulatszámmal), 50 ml-es csövekkel

5.4. Mágneses keverő (10-15 mm) követő elemekkel

5.5. 150 és 200 ml-es főzőpoharak

5.6. 250 és 500 ml-es lombikok

5.7. 60 és 80 mm átmérő közötti üvegtölcsérek

5.8. Gyorsszűrő hamumentes szűrők 150 mm átmérővel (S.S. 5892 S.S. 595 1/2)

5.9. Különböző névleges térfogatú pipetták

5.10. Termosztatikusan szabályozott vízfürdő 37 °C-on

5.11. pH-mérő

5.12. Kjeldahl-féle roncsoló és lepárló készülék csatlakozásokkal

5.13. 25 ml-es beosztásos büretta

5.14. Műanyag mosópalack desztillált vízhez

5.15. Rozsdamentes spatulák

5.16. Hőmérők

5.17. Hőmérséklet-vezérelt szárítószekrény.

6. Vizsgálati eljárás

6.1. A minta előkészítése.

A minta 10-20 grammját dörzsöljük el a mozsárban vagy homogenizáljuk a darálóban, amíg homogén keveréket nem kapunk.

6.2. A tejpor feloldása és a feloldhatatlan maradványok eltávolítása.

6.2.1. Mérjünk ki 1,000 ± 0,002 g alaposan elhomogenizált összetett takarmányt (6.1.) közvetlenül egy 50 ml-es centrifugacsőbe. Adjunk hozzá előzetesen 45 oC-ra melegített 30 ml trinátrium-citrát oldatot (4.1.). A mágneses keverő segítségével keverjük legalább öt percen át.

6.2.2. Centrifugáljuk 500 g-vel (2000 és 3000 közötti percenkénti fordulatszámon) 10 percen át, majd öntsük le a tiszta, világos felülúszót egy 150-200 ml-es főzőpohárba, miközben vigyázunk, hogy a fenéken található laza anyagból semmi ne kerüljön át.

6.2.3. Végezzünk el ugyanezzel az eljárással még két extrakciót a maradékon, és a kivont anyagot öntsük hozzá az elsőhöz.

6.2.4. Ha olajos réteg képződik a felszínen, addig hűtsük a hűtőszekrényben, amíg a zsír meg nem dermed, és egy spatulával vegyük le a szilárd réteget.

6.3. A kazein kicsapása az oltóenzimeivel.

6.3.1. Folyamatos kavargatás mellett adjunk hozzá cseppenként 3,4 ml telített kalcium-klorid oldatot (4.2.) az összes vizes kivonathoz (mintegy 100 ml). A pH-értéket NaOH-(4.3.) vagy HCl-(4.4.) oldat felhasználásával állítsuk be 6,4-6,5-re. Tíz-tizenöt perc időtartamra állítsuk be a termosztatikusan szabályozott, 37 °C-ra állított vízfürdőbe a sóegyensúly kialakulása érdekében. Ez még nyilvánvalóbbá válik, ha enyhe zavarosodás lép fel.

6.3.2. A folyadékot tegyük át egy (vagy két) centrifugacsőbe, majd 10 percen át centrifugáljuk 2000 g erővel a kicsapódott anyag eltávolítása érdekében. A felülúszót az üledék kimosása nélkül tegyük át egy (vagy két) centrifugacsőbe.

6.3.3. A felülúszó hőmérsékletét emeljük meg ismét 37 °C-ra. Az extraktum keverése mellett cseppenként tegyünk bele 0,5 ml folyékony tejoltót (4.5.). A koaguláció egy vagy két percen belül megtörténik.

6.3.4. A mintát tegyük vissza a vízfürdőbe, és 15 percig hagyjuk ott 37 °C-os hőmérsékleten. Azután vegyük ki a vízfürdőből, és kavargatással törjük meg az alvadékot. Centrifugáljuk 10 percig 2000 g-vel. Alkalmas szűrőpapíron szűrjük meg a felülúszót [1] (Whatman No 541 vagy azzal egyenértékű), és tartsuk meg a szűrőpapírt. 50 ml, megközelítőleg 35 oC-os vízzel mossuk ki a csapadékot a centrifugacsőben, miközben kavargatjuk.

Ismét centrifugáljuk 10 percen át 2000 g-vel. Szűrjük meg a korábban megőrzött szűrőpapíron a felülúszót.

6.4. A kazein nitrogéntartalmának meghatározása.

6.4.1. Mosást követően a csapadékot desztillált víz felhasználásával teljes mennyiségben vigyük át a 6.3.4. pont végrehajtása során megőrzött szűrőpapírra. A szűrőpapírt tegyük bele a Kjeldahl-lombikba. A nitrogéntartalmat a Kjeldahl-módszerrel, a 20A 1986 IDF-szabványban leírtak szerint határozzuk meg.

7. Vakpróba

7.1. Vakpróbát rendszeresen kell végeznünk 90 ml (4.1.) nátrium-citrát oldat, 1 ml telített kalcium-klorid (4.2.), valamint 0,5 ml folyékony tejoltó (4.5.) keverékével megnedvesített hamumentes szűrőpapírral (5.8.), amelyet 3 × 15 ml desztillált vízzel kimosunk a - 20A 1986 IDF-szabványban leírtak szerint - Kjeldahl-módszerrel végzett mineralizációját megelőzően.

7.2. A vakpróbához elhasznált sav mennyiségét le kell vonni a minta titrálására használt sav (4.4.) mennyiségéből.

8. Ellenőrzővizsgálat

8.1. A fent említett eljárásnak és reagenseknek az ellenőrzése érdekében egy együttműködési tanulmány keretében meghatározott, ismert mennyiségű soványtejpor-tartalommal rendelkező standard összetett takarmányokból is végezzünk meghatározást. A kettős meghatározás átlagos eredményének eltérése az együttműködési tanulmányban kapott eredménytől nem haladhatja meg az 1 %-ot.

9. Az eredmények kifejezése

9.1. Az összetett takarmányokban jelen lévő sovány tejpor százalékos mennyiségét a következő képlettel számíthatjuk ki:

% MMP =

27,5

-2,81

0,908

ahol N a para-kazein százalékos nitrogéntartalma; 27,5 a meghatározott kazeinnek a sovány tejpor százalékára való átszámítási tényezője; 2,81 és 0,908 a regresszióanalízis során nyert korrekciós tényezők.

10. A módszer pontossága

10.1. Ismételhetőség

A tanulmányozott esetek legalább 95 %-ában az ugyanazon a mintán, ugyanazon laborszemélyzet által, ugyanabban a laboratóriumban elvégzett kettős elemzések eredményei között megfigyelhető eltérés 100 gramm összetett takarmányra számítva nem lehet nagyobb 2,3 g sovány tejpornál.

10.2. Reprodukálhatóság

A tanulmányozott esetek legalább 95 %-ában az ugyanazon a mintán, különbőző laboratóriumban elvégzett elemzések eredményei között megfigyelhető eltérés 100 gramm összetett takarmányra számítva nem lehet nagyobb 6,5 g sovány tejpornál.

11. Tűréshatár

A CrD95-érték (kritikus eltérés; 95 %-os konfidencia határ) kiszámításához a következő képletet lehet igénybe venni (ISO 5725):

CrD

(R: reprodukálhatóság; r: ismételhetőség)

Kettős meghatározás: CrD95 = 4,5 g

Ha a vegyi elemzés eredménye a deklarált soványtejpor-tartalomtól kettős meghatározás esetén 4,5 g-ot meg nem haladó mennyiségben tér el, az összetettakarmány-szállítmányt úgy kell tekinteni, mint amely megfelel az ebben a rendeletben előírt követelményeknek.

12. Észrevételek

12.1. Bizonyos nem tej eredetű fehérjék és különösen szójafehérjék nagy százalékban való adagolása, ha azokat a sovány tejporral együtt hevítik, a tej para-kazeinjával való együttes kicsapódás miatt túlságosan magas eredményeket okozhat.

12.2. Író adagolása némileg alacsonyabb számokat eredményezhet, annak következtében, hogy csak a zsírmentes frakciót határozzuk meg. Bizonyos mennyiségű savanyú író hozzáadása meglehetősen alacsony számértékeket eredményezhet, mert az a citrátos oldatban nem oldódik fel teljesen.

12.3. A 0,5 % vagy annál nagyobb mennyiségben hozzáadott lecitin szintén alacsonyabb eredményhez vezethet.

12.4. Erősen hőkezelt sovány tejpor bekeverése szintén túlságosan magas értékekhez vezethet bizonyos savófehérjék a tej para-kazeinjének együttes kicsapódása következtében.

[1] Gyorsan szűrő, hamumentes papírt kell alkalmazni.

--------------------------------------------------

XXIII. MELLÉKLET

(17. cikk)

KEMÉNYÍTŐ MINŐSÉGI MEGHATÁROZÁSA SOVÁNY TEJPORBAN, DENATURÁLT TEJPORBAN ÉS ÖSSZETETT TAKARMÁNYOKBAN

1. Tárgy

Ez a módszer a denaturált tejporokhoz jelölőanyagként adagolt keményítő kimutatására alkalmas.

A módszer kimutatási határa megközelítőleg 0,05 g keményítő a minta 100 grammjában.

2. A módszer elve

A reakció a jodometriában alkalmazott alapelven nyugszik:

- a szabad jód megkötése vizes oldatban kolloidok által,

- abszorbció keményítőszemcsék és elszíneződés által.

3. Vegyszerek

3.1. Jódoldat

- jód: 1 g,

- kálium-jodid: 2 g,

- desztillált víz: 100 ml.

4. Eszközök

4.1. Analitikai mérleg

4.2. Vízfürdő

4.3. Kémcsövek, 25 mm × 200 mm

5. Vizsgálati eljárás

Mérjünk ki 1 g mintát, és tegyük bele a kémcsőbe (4.3.).

Adjunk hozzá 20 ml desztillált vizet, és rázogatással oszlassuk el benne a mintát.

Helyezzük forrásban lévő vízfürdőbe, és hagyjuk ott öt percig (4.2.).

Vegyük ki a vízfürdőből, és hűtsük szobahőmérsékletűre.

Adjunk hozzá 0,5 ml jódoldatot (3.1.), rázzuk fel, és figyeljük meg az eredményül kapott színt.

6. Az eredmények kifejezése

A kék elszíneződés azt jelzi, hogy a mintában nyers keményítő van jelen.

Ha a minta módosított keményítőt tartalmaz, a szín nem biztos, hogy kék lesz.

7. Észrevételek

A keményítő színe, a szín intenzitása és a keményítő mikroszkópos megjelenése a nyers keményítő eredete (például kukorica vagy burgonya), illetve a mintában jelen lévő módosított keményítő típusa szerint változhat.

A módosított keményítők jelenléte a kapott színt ibolyára, vörösre vagy barnára változtathatja, attól függően, hogy a nyers keményítő kristályszerkezete milyen mértékben módosult.

--------------------------------------------------

XXIV. MELLÉKLET

(18. cikk)

NEDVESSÉGTARTALOM MEGHATÁROZÁSA SAVANYÚ ÍRÓPORBAN

1. Tárgy

Állati takarmányozásra szánt savanyú írópor nedvességtartalmának meghatározása.

2. A módszer elve

A mintát vákuumban szárítjuk. A tömegveszteséget méréssel állapítjuk meg.

3. Eszközök

3.1. Analitikai mérleg

3.2. Száraz tartóedények rozsdamentes fémből vagy üvegből, légmentes zárást biztosító fedőkkel; a munkafelületnek lehetővé kell tennie a minta 0,3 g/cm2 vastagságban történő eloszlatását.

3.3. Állítható, elektromos fűtésű vákuumkályha olajszivattyúval felszerelve, amely alkalmas forró, száraz levegő vagy szárítószer (nedvszívó) bevezetésére (például kalcium-oxid).

3.4. Hatékony szárítószerrel ellátott exszikkátor.

3.5. Termosztátos szabályozással ellátott, 102 ± 2 °C-ra állított, levegőztetett szárítószekrény.

4. Vizsgálati eljárás

Az egyik edényt (3.2.) fedőjével együtt legalább egy órán keresztül melegítsük a szárítószekrényben (3.5.). A fedőt helyezzük rá az edényre, és azonnal tegyük bele az exszikkátorba (3.4.), majd hagyjuk szobahőmérsékletűre hűlni, és mérjük le 0,5 mg pontossággal.

Az egyik edényt (3.2.) fedőjével együtt mérjük le 0,5 mg pontossággal. A lemért edénybe 1 mg-os pontossággal mérjünk körülbelül 5 g mintát, és azt egyenletesen oszlassuk el. Az edényt fedő nélkül helyezzük a 83 °C-re előfűtött vákuumkályhába (3.3.). A vákuumkályha belső hőmérsékletének nem kívánatos csökkenését elkerülendő, az edényt a lehető leggyorsabban helyezzük bele.

A nyomást állítsuk be 100 Torr-ra (13,3 kPa), és hagyjuk száradni négy órán keresztül forró, száraz légáram alatt, vagy szárítószer használatával (20 mintára körülbelül 300 g). Ez utóbbi esetben a vákuumszivattyút az előírt nyomás elérését követően le kell választani. A szárítási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a kályha hőmérséklete visszaáll 83 °C-ra. Óvatosan állítsuk vissza a kályhába a légköri nyomást. Nyissuk ki a kályhát, azonnal helyezzük a fedőt az edényre, az edényt távolítsuk el a kályhából, hagyjuk 30-45 percig hűlni az exszikkátorban (3.4.), és mérjük meg egy milligrammos pontossággal. Szárítsuk még egyszer 30 percig a vákuumkályhában (3.3.) 83 °C-on, majd ismét mérjük meg. A két mérés közötti különbség nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át.

5. Számítás

100E

ahol:

E = a kiindulási tömeg a vizsgálati minta grammjaiban megadva,

m = a száraz vizsgálati minta tömege grammokban megadva.

6. Pontosság

6.1. Ismételhetőségi határérték

A lehető legrövidebb időn belül ugyanazon laboratóriumi személy által, azonos felszereléssel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a 0,4 g vizet 100 gramm savanyú íróporra számítva.

6.2. Reprodukálhatósági határérték

Különbőző laboratóriumokban lévő személyzet által, különbőző eszközzel, azonos vizsgálati anyagon elvégzett két meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a 0,6 g vizet 100 gramm savanyú íróporra számítva.

6.3. A pontossági adatok forrása

A pontossági adatokat egy 1995-ben elvégzett kísérlet szolgáltatta, amelyben 8 laboratórium és 12 minta (hat azonosítatlan minta) vett részt.

--------------------------------------------------

XXV. MELLÉKLET

(19. cikk)

REFERENCIAMÓDSZER A TEJZSÍRBAN LÉVŐ IDEGEN ZSÍROK KIMUTATÁSÁRA TRIGLICERIDEK GÁZKROMATOGRÁFIÁS ELEMZÉSÉVEL - 1. ÁTDOLGOZOTT VÁLTOZAT

1. Tárgy és alkalmazási terület

Ez a szabvány az idegen eredetű, mind növényi, mind állati zsírok, mint a marhafaggyú vagy a sertészsír tejtermékekből való kimutatásának a trigliceridek gázkromatográfiás elemzésével végzett módszerét ismerteti.

A növényi, illetve állati eredetű zsírokat előre meghatározott trigliceridképletek alkalmazásával mind mennyiségi, mind minőségi tekintetben ki lehet mutatni a tiszta tejzsírból, függetlenül a takarmányozási és a laktációs körülményektől.

1. megjegyzés:

Bár a kizárólag csak tejzsírban előforduló vajsav (C4) lehetővé teszi a növényi zsírokban megtalálható tejzsír kis és közepes mennyiségeinek mennyiségi becslését, minőségi és mennyiségi tekintetben vett információ nehezen nyerhető a tiszta tejzsírhoz legalább 20 tömegszázaléknyi mennyiségben hozzáadott idegen zsír esetében, tekintettel arra, hogy a C4 igen tág határok között, megközelítőleg 3,5-4,5 % tömegszázaléknyi mennyiség között ingadozik.

2. megjegyzés:

Mennyiségi eredményeket gyakorlatilag csak trigliceridanalízissel lehet nyerni, miután a növényi zsírok szterintartalma a termelési és kezelési körülményektől függően eltérő lehet.

2. Fogalommeghatározás

A tejben lévő idegen zsírok: az e szabvány szerint meghatározott idegen zsírok, a tejzsír kivételével, minden növényi és állati zsír.

3. A módszer elve

A tejzsír extrakcióját követően törzsoldatot készítünk. Ebből az oldatból töltött oszlopon végzett gázkromatográfiával határozzuk meg az összes szénatomszám alapján a triglicerideket. A különböző méretű (C 24-C 54 - csak páros számú) zsírmolekulák tömegszázalékának a trigliceridképletbe történő behelyettesítésével az idegen eredetű zsírok minőségileg kimutathatók vagy mennyiségileg meghatározhatók.

Megjegyzés:

Az itt meghatározott értékelési módszer betartása mellett kapilláris gázkromatográfiát is lehet alkalmazni, ha garantáltan egymással egybevethető eredményeket kapunk [1].

4. Vegyszerek

Analitikai tisztaságú vegyszereket használjunk.

4.1. Vivőgáz: legalább 99,996 % tisztaságú nitrogén.

4.2. Standard trigliceridek [2], telítettek, illetve koleszterin a standard tejzsírnak a 6.5.4. pont szerinti standardizálásáhaz.

4.3. Vízmentes metil-alkohol.

4.4. n-hexán

4.5. n-heptán

4.6. Toluol

4.7. Dimetil-klórszilán oldat: 50 ml dimetil-klórszilán 283 ml toluolban feloldva.

4.8. Éghető gáz: hidrogén és szintetikus levegő

4.9. Állófázis, 3- % OV- 1125/150 μm (100/120 mesh) Gas ChromQ. [3]

4.10. 10 %-os kakaóvajoldat

5. Eszközök

Szokásos laboratóriumi eszköz, különösen a következők:

5.1. Magas hőmérsékleten működő gázkromatográf, amely alkalmas legalább 400-450 °C-on történő kromatografálásra, lángionizációs detektorral (FID), és állandó tömegű áramlásszabályozóval felszerelve a vivőgáz számára. Éghető gáz: 30 ml/perc H2, 270 ml/perc szintetikus levegő.

Tekintettel a vivőgáz nagy mennyiségben történő átáramlására, a lángcsóvának különösen nagynak kell lennie.

Megjegyzés:

A trigliceridanalízis során előforduló magas hőmérsékletek miatt a lángionizációs detektorba, illetve az injektor rendszerbe illesztett üvegbetéteket gyakran kell tisztítani.

A gázkromatográfiás eszköznek nagy hőmérsékletnek is ellenálló szeptumokat kell tartalmaznia, amelyek általában gyakori használat esetén is csupán igen kis mértékű "elszivárgást" mutatnak.

Megjegyzés:

A Chrompack Chromblue- (tm) szeptum megfelelő.

A szeptumot rendszeres időközönként cserélni kell, így legalább minden 100 injektálást követően, illetve amint a felbontás csökken (lásd a 4. ábrát).

5.2. A kromatográfiás oszlop

U-alakú üvegoszlop, belső átmérője 2 mm, hossza 500 mm, amelyet az üvegfelszín aktivitásának semlegesítésére először dimetil-klórszilánnal a 6.1. pont szerint szilanizálni kell.

Megjegyzés:

Valamivel hosszabb (80-200 mm hosszúságú) töltött kolonna is használható. Ezekkel valamivel jobb reprodukálhatósági értékek érhetők el. Másrészről viszont az állófázis a művelet végrehajtása során alkalmanként megszakadhat, aminek következtében rosszabbak lehetnek a mennyiségi eredmények. Ezen túlmenően, a lángionizációs detektor lángja könnyen kialszik az igényelt rendkívül nagy, 75 és 85 ml/perc közötti vivőgázáram következtében.

5.3. Az oszlop megtöltéséhez szükséges elrendezés (lásd az 1. ábrát)

+++++ TIFF +++++

5.3.1. Műanyag oszlop a végére csavarható lezáró kupakkal, jellel ellátva, ameddig a szükséges mennyiségű állófázis tölthető.

5.3.2. Finomszűrő (mesh mérete megközelítőleg 100 μm) csavaros kupakkal, amely alkalmas az üvegoszlop 1. ábra szerinti lezárására.

5.3.3. Deaktivált, szilanizált üveggyapot

5.3.4. Vibrátor az állófázis egyenletes eloszlatására a töltés folyamán

5.4. Szilikagéllel ellátott, 1-3 ml-es Extrelut-oszlop [4]. Ez az oszlop a tejzsír kivonására is használható.

5.5. 6,4 mm-es (1/4″) grafittömítés 6 mm-es furattal

5.6. Az üvegfelületek szilanizálására alkalmas eszköz a 6.1. pont szerint

5.6.1. Woulff-lombik

5.6.2. Vízsugárszivattyú

5.7. (50 ± 2) °C-ra beállítható vízfürdő

5.8. (50 ± 2) °C és (100 ± 2) °C hőmérsékletre beállítható szárítószekrény

5.9. Mikroliteres pipetta

5.10. 5 ml-es beosztásos pipetta 1,5 ml metil-alkohol adagolására

5.11. 50 ml-es kerekfenekű lombik

5.12. Erlenmeyer-lombik 50 ml névleges űrtartalommal

5.13. Tölcsér

5.14. Finompórusos szűrő

5.15. Rotációs bepárló

5.16. 1 ml névleges űrtartalommal rendelkező, alumíniumkupakkal zárható ampullák, belsejükben szeptummal

5.17. Injekciós fecskendő, a fecskendő adagolódugattyúja nem érhet bele a tű csúcsába.

Megjegyzés:

Az ilyen fecskendők a kapott eredmények jobb reprodukálhatóságát teszik lehetővé.

A szeptum sérülésének elkerülése érdekében a tű hegyét (például sztereó mikroszkóppal) rendszeresen ellenőrizni kell.

6. Vizsgálati eljárás

6.1. Az oszlop előkészítése (szilanizálás)

Miután - ahogy azt a 2. ábra mutatja - a Woulff-lombikot csatlakoztatták a vízsugárszivattyúhoz, a 2-es csövet a 4.7. pont szerinti oldatba belemerítik. A zárócsap lezárásával az oszlop megtöltődik: ezt követően a két csövet eltávolítják.

+++++ TIFF +++++

Az oszlopot egy állványon rögzítjük, és egy pipetta segítségével teljes egészében megtöltjük a dimetil-klórszilán oldattal.

Mintegy 20-30 perc elteltével a Woulff-lombikot egy szűrőlombikkal helyettesítjük, és az oszlopot a vízsugárszivattyúra csatlakoztatva leürítjük (lásd a 3. ábrát).

6.2. Az oszlop feltöltése

Ezt követően 75 ml toluol és 50 ml metil-alkohol felhasználásával többször egymásután átöblítjük, majd a kiürített oszlopot a szárítószekrényben 100 °C-on megközelítőleg 30 percen át szárítjuk.

+++++ TIFF +++++

Az oszlop megtöltéséhez az 1. ábrán bemutatott elrendezést használjuk. A 4.9. pont szerinti állófázist a műanyag oszlop jeléig töltjük fel. A megtöltendő üvegoszlop alsó végét lezárjuk egy megközelítőleg 1 cm hosszú, előzetesen már szilanizált üveggyapotdugóval, amelyet egy acélrúddal nyomunk bele. Ezt követően az oszlop végét az 5.3.2. pont szerinti szitával zárjuk le.

Az oszlopot nyomás alatt (3 bar, N2 atmoszféra) töltjük meg az állófázissal. Az egységes, folyamatos és erős kitöltés elérése érdekében a töltés ideje alatt egy vibrátort mozgatunk fel-alá az üvegoszlopon.

A töltés befejeztével egy szilanizált üveggyapot dugót nyomunk a megtöltött oszlop másik végébe, a kitüremkedő végét levágjuk, és a bennmaradó dugót egy spatulával még néhány milliméterre belenyomjuk az oszlopba.

6.3. A minták előkészítése

A minták előkészítését a következő három módszer valamelyikével kell végezni:

6.3.1. A tejzsír elkülönítése a vajból

5-10 g vajat egy alkalmas edényben az 5.7. pont szerinti vízfürdőben 50 °C-on megolvasztunk.

Egy 50 ml űrtartalmú Erlenmeyer-lombikot és az 5.14. pont szerinti szűrővel ellátott tölcsért szárítószekrényben 50 °C-ra hevítünk. Az olvadt vaj zsírrétegét az előmelegített eszköz segítségével szűrjük le.

Az ilyen tejzsír majdnem teljesen mentes a foszfolipidektől.

6.3.2. A zsír-frakció extrahálása a Röse-Gottlieb-módszer szerint

Az extrahálást vagy az 1C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 vagy a 22B: 1987 IDF-szabvány szerint végezzük

Ilyen tejzsír esetén a foszfolipidek megközelítőleg 0,1 %-kal megnövelt koleszterincsúcsot eredményeznek.

A koleszterinnel 100-ra beállított trigliceridspektrumra gyakorolt hatás ezáltal elhanyagolható.

6.3.3. Extrakció tejből szilikagéloszlopokkal

Egy 0,7 ml-es, 20 °C-ra temperált tejmintát az 5.4. pont szerinti mikroliteres pipettával beviszünk egy 1-3 ml-es Extrelut-oszlopra, majd hagyjuk, hogy ott megközelítőleg öt perc alatt egyenletesen eloszoljon a szilikagélen.

A proteinlipid-komplexek denaturálása érdekében 1,5 ml metil-alkoholt adunk hozzá pipettával. Ezt követően a mintát 20 ml n-hexánnal extraháljuk. Az n-hexánt lassan, kis mennyiségekben adjuk hozzá, és a lecsöpögő oldószert egy 50 ml-es kerekfenekű lombikban fogjuk fel, amelyet előzetesen ismert, állandó tömegig szárítottunk.

Extrahálást követően, az oszlopot száradásig hagyjuk kiürülni.

Az eluátumból rotációs bepárlóban, 40-50 °C hőmérsékletű vízfürdőben kidesztilláljuk az oldószereket.

A lombikot megszárítjuk, és a kapott zsír mennyiségét méréssel meghatározzuk.

Megjegyzés:

A Gerber-, Weibull - Berntrop-, Schmid - Bondzynski - Ratzlaff-módszer szerinti zsír extrahálás vagy a tejzsír izolálása detergensekkel (BDI-módszer) nem megfelelő trigliceridanalízisre, mivel ezekkel a módszerekkel többé-kevésbé nagymennyiségű részleges gliceridek vagy foszfolipidek mehetnek át a zsírfázisba.

6.4. A mintaoldat elkészítése

A gázkromatográfia céljaira a 6.3. pont szerint nyert, 5 %-os n-heptános zsíroldatot használunk. Ennek a mintának az elkészítéséhez a 6.3.1. és 6.3.2. pont szerint nyert minta anyagának megfelelő mennyiségeit lemérjük, és megfelelő mennyiségű n-heptánban oldjuk.

A 6.3.3. pont szerinti minta előkészítésénél a lombikban található mintaanyaghoz adandó n-heptán mennyiségét súlymérés és a benne oldódott visszamaradt anyag alapján számítjuk ki.

A mintaoldatból megközelítőleg 1 ml-t az 5.16. pontban meghatározott ampullába töltünk.

6.5. A trigliceridek gázkromatográfiás meghatározása

A hosszú szénláncú C52-C56-os trigliceridek eluálásának magas, legfeljebb 350 °C-os hőmérsékletén az alapvonal emelkedése könnyen bekövetkezik, különösen akkor, ha az oszlopokat az elején nem megfelelően kondicionáltuk. Az alapvonalnak ezt, a magas hőmérsékleten bekövetkező emelkedését teljes mértékben el lehet kerülni két oszlop kombinációjával, vagy alapvonal-kivonással.

A kompenzációs üzemmódban, illetve az egyoszlopos műveleteknél, valamint az injektorban és a detektorban lévő üvegbetétekhez is, az 5.5. pont szerinti grafittömítéseket kell alkalmazni.

6.5.1. Alapvonal-korrekció

Az alapvonal emelkedésének elkerülésére a következő négy módszer valamelyikét lehet igénybe venni:

6.5.1.1. Oszlopok kombinációja

Két töltött oszlopot alkalmazunk kompenzációs üzemmódban.

6.5.1.2. Alapvonal korrekciója a gázkromatográffal

Ha a gázkromatográfot egy alkalommal a zsíroldat beinjektálása nélkül futtatjuk, a tárolt alapvonal ezt követő kivonásával az alapvonal emelkedése elkerülhető.

6.5.1.3. Alapvonal korrekciója szoftveres integrálással

Ha az integráló készüléket egy alkalommal a zsíroldat beinjektálása nélkül futtatjuk, a tárolt alapvonal ezt követő kivonásával az alapvonal emelkedése elkerülhető.

6.5.1.4. Alapvonal korrekciója megfelelő kondicionálással

A kiinduláskor az oszlop megfelelő kondicionálásával és megközelítőleg 20 tejzsíroldat injektálásával az alapvonal emelkedése nagy hőmérsékleten gyakran olyan kicsi, hogy az alapvonal korrekciójára nem lesz szükség.

6.5.2. Injektálási technika

A különbséget okozó hatások elkerülésére, a magas forráspontú triglicerid-komponenseknél a kedvezőbb mennyiségi eredmények elérése érdekében a "forró injektálás" módszerét alkalmazzuk. Ilyenkor a zsíroldatot felszívjuk a fecskendőbe, majd a fecskendő hideg tűjét megközelítőleg három másodpercig forrósítjuk a befecskendezést megelőzően az injektorfejben. Ezt követően a fecskendő tartalmát gyorsan beinjektáljuk.

Megjegyzés:

Ennél az injektálási módszernél a frakcionálódás kockázata a fecskendőben vagy az injektálási blokkban kisebb. Az "oszlopra" történő közvetlen injektálást a torony felső, meghosszabbított és melegített szakaszán nem végzünk, mert a szeptum töredékei, amelyek itt gyűlnek össze, valamint a szennyeződések is könnyen eltávolíthatók az alkalmazott technikával anélkül, hogy szét kellene szedni az oszlopot, ha rendszeresen váltogatjuk az injektor betétjét.

A tű végének behajlását, amelyet a mintát tartalmazó főzőpohár fenekéhez való hozzáérintés eredményezhet (még ha az szabad szemmel alig látható is), mindenképpen el kell kerülnünk, ha nem akarjuk megsérteni a szeptumot.

+++++ TIFF +++++

6.5.3. A töltött oszlop kondicionálása

Az a)-c) lépések során a szennyeződések elkerülése végett az oszlop tetejét nem csatlakoztatjuk a detektorhoz.

A 6.2. pont szerint feltöltött oszlopokat a következő módon tudjuk kondicionálni:

a) 15 percig 40 ml/perc N2-átáramoltatás 50 °C-on;

b) Melegítés 1 K/perc sebességgel 355 °C-ig 10 ml N2/perc áramlási sebesség mellett;

c) A 355 °C fenntartása 12-15 órán át;

d) a 4.10. pont szerinti kakaóvajoldatból kétszer 1 μl beinjektálása, és a hozzá tartozó hőmérséklet program;

e) két-három napon keresztül 20 alkalommal 0,5 μm 6.4. pont szerinti tejminta befecskendezése.

Megjegyzés:

A kakaóvaj majdnem kizárólag magas forráspontú (C50-C56) trigliceridekből áll. A kakaóvaj befecskendezése azt a célt szolgálja, hogy ebben a hosszú szénláncú tartományban kondicionáljunk. A magas forráspontú (C50-C54) trigliceridek esetében előfordulhat részleges választényező is megközelítőleg 1,20 nagyságrendig. Rendes esetben tejzsíroldat ismételt befecskendezésével a C50-C54 közötti, kezdetben magas választényezők csökkenése várható. Alacsony acilált szénatomszámmal rendelkező triglicerideknél a tényezők az 1 felé közelítenek. Három, a 6.2. pont szerint megtöltött oszloppárt készítünk. A kondicionált párokat rutinvizsgálatok céljaira tejzsírelemzéssel ellenőrizzük.

A továbbiakban a legjobb mennyiségi eredményt adó (egyhez közelítő választényezővel rendelkező) oszloppárt használjuk. A 1,20 < választényezőjű oszlopot nem használjuk.

6.5.4. Kalibrálás

Kalibráláshoz a megfelelő trigliceridek választényezőit, valamint a tejzsír (standardizált zsír) koleszterinjének választényezőit kell meghatározni standardizált trigliceridek felhasználásával (legalább C24, C30, C36, C42, C48 és C54, szénatomszámú telített triglicerideket valamint koleszterint, még jobb további C50 és C52-vel). A közbeeső választényezőket matematikai interpolációval nyerhetők.

A standardizált zsírok használatával két vagy három kalibrálást kell minden nap végrehajtani. Ha majdnem azonos eredményeket kapunk, az azt jelenti, hogy a minták trigliceridnalízisével jól reprodukálható mennyiségi eredmények érhetők el.

A standardizált tejzsír eltarthatósági ideje legfeljebb -18 °C tárolási hőmérsékleten több hónap, így standardként felhasználható.

Megjegyzés:

Az egyes összetevők választényezőjét igazolt triglicerid-összetételű standardizált zsírral is meg lehet határozni, például CRM 519-el (vízmentes tejzsír), amely a Referenciaanyagok és Mérések Intézetéből, a belgiumi Geelből szerezhető be.

6.5.5. A trigliceridanalízishez szükséges hőmérsékletprogram, vivőgáz és egyéb körülmények

Hőmérsékletprogram: az oszlop kiindulási hőmérséklete 210 °C, hőntartás egy percig, majd programozzuk be 6 °C/perc emelkedésre 350 °C-ig, végül ezt a hőmérsékletet tartsuk fenn öt percig.

A detektor és az injektor hőmérséklete: 370 oC.

Megjegyzés:

A detektor, az injektor és a termosztát hőmérsékletét (kiindulási hőmérséklet) állandó szinten kell tartani (éjszakára, hétvégére, és munkaszüneti napok alatt is).

Vivőgáz: nitrogén, áramlási sebessége 40 ml/perc.

Megjegyzés:

Ha 80 cm-es oszlopokat használunk, az átáramlási sebességnek legalább 75 ml/perc N2-nek kell lennie. A vivőgáz áramlási sebességét állandó értéken kell tartani (éjszakára, hétvégére, és munkaszüneti napok alatt is). A vivőgáz pontos áramlási sebességét oly módon kell beszabályozni, hogy a C54 az oszlop hosszától függetlenül 341 °C-on történjen.

Analízisidő: 29,3 perc.

Beinjektált mennyiség: 0,5 μl.

Megjegyzés:

A fecskendőt minden injektálást követően tiszta heptánban többször el kell öblíteni.

A lángionizációs mérő (FID) paramétereit az 5.1. pont szerint állítsuk be.

Megjegyzés:

A lángionizációs mérőt minden nap munkakezdéskor kell begyújtani.

7. Integrálás, értékelés és a mérési körülmények ellenőrzése

Páratlan acilált szénatomszámmal rendelkező triglicerideket (2n + 1) az előttük álló páros szénatomszámú trigliceriddel kombináljuk (2n). A rosszabbul reprodukálható, alacsony C56-tartalmat nem vesszük figyelembe. A kromatogramban ezek után fennmaradó triglicerideket (csúcs alatti terület) - a koleszterint is beleértve (a C24-hez közeli csúcs) - megszorozzuk a zsírminta megfelelő választényezőivel (utolsó kalibráció), és az összest 100-ra normalizáljuk. A szabad koleszterinen kívül ezáltal a C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52, valamint a C54 szénatomos triglicerideket is lehet értékelni. Az eredményeket tömegszázalékban fejezzük ki (g/100 g).

A kromatogram csúcsainak értékelését integrálógéppel végezzük, amellyel meghúzható az alapvonal. Az optimalizált integrációs paraméterekkel végzett újra integrálást is lehetővé kell tenni.

Az 5. és 6. ábra két trigliceridkromatogram-példát mutat be. Az 5. ábrán látható kromatogram kiválóan értékelhető, míg a 6. ábra egy C50 és C54 közötti tartományban jelentkező sporadikus hibát tartalmaz, és az 5. ábrához képest itt az alapvonal már helytelenül van felrajzolva. Ilyen típushibákat nagy biztonsággal csak olyan integrátor használatával lehet azonosítani és elkerülni, amely felrajzolja az alapvonalat.

+++++ TIFF +++++

A mérési körülmények ellenőrzése érdekében az 1. táblázatban a különféle trigliceridekre megadott relatív szórásokat (RSD: variációs együttható × 100) lehet használni. Ugyanannak a tejzsírmintának egymás után elvégzett 19 elemzéséből számították ki őket.

1. táblázat

A trigliceridtartalom relatív szórása (RSD) (n = 19)

Triglicerid | RSD (%) |

C24 | 10,00 |

C26 | 2,69 |

C28 | 3,03 |

C30 | 1,76 |

C32 | 1,03 |

C34 | 0,79 |

C36 | 0,25 |

C38 | 0,42 |

C40 | 0,20 |

C42 | 0,26 |

C44 | 0,34 |

C46 | 0,37 |

C48 | 0,53 |

C50 | 0,38 |

C52 | 0,54 |

C54 | 0,60 |

Ha az RSD-értékek jelentős mértékben meghaladják az 1. táblázatban adott értékeket, a kromatogram elkészítésének körülményei nem megfelelőek, és ellenőrizni kell a szeptumokat vagy a vivőgáz áramlási sebességét. Továbbá, az is előfordulhat, hogy a szeptum apró darabkái lerakódtak az oszlop bejáratánál található üveggyapotra, vagy az oszlop vált használatra alkalmatlanná elöregedés, hőmérsékleti hatások vagy egyéb ok miatt (lásd a 3. ábrát).

Megjegyzés:

Az 1. táblázatban adott értékek nem kötelezőek, de minőségellenőrzési szempontból jelzésértékűek. Mindazonáltal, ha magasabb RSD-értékeket fogadunk is el, attól még be kell tartani a 11. pontban megadott ismételhetőségi és reprodukálhatósági határértékeket.

8. Idegen zsírok minőségi kimutatása

Az idegen zsírok kimutatása érdekében S-határértékekkel (3. táblázat) rendelkező trigliceridképleteket (2. táblázat) dolgoztak ki, melyekben a tiszta tejzsír S-értékei ingadozhatnak. Ha ezeknek a határértékeknek a túllépése fordul elő, feltételezhető az idegen zsírok jelenléte.

A legérzékenyebb képlet, amely a sertészsír kimutatására szolgál, például a következő:

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S

Megjegyzés:

755 különböző tejzsírmintából az S 99 %-os konfidenciatartományára = 97,96-102,04 közötti értékeket állapítottak meg tiszta tejzsírmintákra az összes S-érték SD = 0,39897 szórása mellett.

Ismeretlen zsírminta triglicerid-összetételéből kiindulva az ilyen képlet lehetővé teszi, hogy számítógép használata nélkül, egyszerű úton igazolni lehessen, hogy az itt bemutatott trigliceridtartalmak összege a megfelelő tényezőkkel együtt kívül esik-e a 97,96-102,04-es tartományon, amely esetben valószínűleg idegenzsír-hozzáadással van dolgunk.

A különböző idegen zsírok kimutatására a 2. táblázat különböző trigliceridképleteket mutat be. Az idegen zsírok kimutatására szója-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukoricacsíra-, gyapotmag- és hidrogénezett halolaj esetében, növényi zsíroknál kókuszdió- és pálmamag-zsír, valamint pálmaolaj és marhafaggyú esetében közös képletek használhatók.

Miután az idegen zsírok triglicerid-összetétele szintén mutat bizonyos ingadozásokat, ugyanazon típusra maximum négyféle, kísérletben kimért idegenzsír-trigliceridadatot használtak fel. (Ugyanarra az idegen zsírtípusra a legkevésbé előnyös határértékeket vették figyelembe (lásd a 4. táblázatot)).

A következő "összesített" képlet használatával szintén hasonlóan jó eredmények kaphatók a teljes idegenzsír-tartalomra:

- 2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 - 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 - 5,0336 · C42 + 0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S

A tejzsírban található idegen zsírok kombinációira végzett számítások azt mutatták, hogy például, bár a sertészsírra a 2. táblázatban megadott képlet esetében a határérték igen alacsony, nevezetesen 2,7 %, más zsírok, például a kókuszdió zsírja, a pálmaolaj vagy pálmamag zsírja, amelyeknek a kimutathatósági határa igen magas, 26,8 %, 12,5 %, illetve 19,3 % rendre, csak akkor mutathatók ki ezzel a képlettel, ha rendkívül nagy mennyiségekben keverték hozzá a tejzsírhoz. Ugyanez érvényes a 2. táblázat más képleteire is.

2. táblázat

Különböző idegen zsírok jelenlétének tejzsírból való kimutatására alkalmas trigliceridképletek az S-érték szórásának (SD) feltüntetésével

Szójabab-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukoricacsíra-, gyapotmag- és halolaj esetében alkalmazott képlet

2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 - 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 + 1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157

Kókuszdió- és pálmamagzsír esetében alkalmazott képlet

3,7453 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 · C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,1226 · C48 + 1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323

Pálmaolaj és marhafaggyú esetében alkalmazott képlet

3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 - 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 - 0,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 - 4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094

Sertészsír esetében alkalmazott képlet

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897

Ezért egy ismeretlen zsírminta ellenőrzésekor a 2. táblázatban megadott összes képletet és az összesített képletet (2.) is használni kell, ha a minta nagy valószínűséggel tejzsírnak és a 14 különböző féle idegen zsír valamelyikének, vagy ezen zsírok valamilyen kombinációjának a keveréke. Ha egy elemzendő zsírminta trigliceridjének behelyettesítésével egy olyan S-értéket nyerünk, amely a 3. táblázatban az 5 képlet közül mindössze egynek a tartományán esik kívül, akkor a minta nagy valószínűséggel módosított tejzsír. A 2. táblázat négy képletéből egynek a segítségével tejzsírból kimutatott idegen zsír jelenléte azonban még nem engedi következtetések levonását az idegenzsír-keverék típusára vonatkozóan.

3. táblázat

S-határértékek tejzsírokra

A következő anyagok kimutatására alkalmazott képlet: | S-tartomány |

Szójabab-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukoricacsíra-, gyapotmag-, halolaj | 98,05-101,95 |

Kókuszdió- és pálmamagzsír | 99,42-100,58 |

Pálmaolaj és marhafaggyú | 95,90-104,10 |

Sertészsír | 97,96-102,04 |

Teljes képlet | 95,68-104,32 |

A 4. táblázatban a különböző idegen zsírok kimutathatósági határértékét 99 %-os konfidenciaszinten adták meg. Az első oszlop a legkisebb kimutathatósági határértékeket mutatja a 2. táblázat legjobb tejzsír képleteire. A második oszlopban az összesített képletre érvényes kimutathatósági határértéket adjuk meg. Bár a határértékek valamivel magasabbak, csak erre a képletre van szükség, ha valamivel nagyobb mértékű idegen zsír jelenlétét akarjuk kimutatni. Valamennyi képlettel ki lehet mutatni a különböző idegen zsírok kombinációit is. Az azonos típusú különböző idegen zsírok trigliceridjeinek változási tartományai nincsenek jelentős hatással a kimutatási határértékekre.

4. táblázat

A 99 %-os kimutathatósági határértékek a tejzsírhoz adott idegen zsír százalékában

| Egyedi képlet | Összesített képlet |

Szójababolaj | 2,1 | 4,4 |

Napraforgóolaj | 2,3 | 4,8 |

Olívaolaj | 2,4 | 4,7 |

Kókuszdiózsír | 3,5 | 4,3 |

Pálmaolaj | 4,4 | 4,7 |

Pálmamagzsír | 4,6 | 5,9 |

Repceolaj | 2,0 | 4,4 |

Lenmagolaj | 2,0 | 4,0 |

Búzacsíraolaj | 2,7 | 6,4 |

Kukoricacsíra-olaj | 2,2 | 4,5 |

Gyapotmagolaj | 3,3 | 4,4 |

Sertészsír | 2,7 | 4,7 |

Marhafaggyú | 5,2 | 5,4 |

Hidrogénezett halolaj | 5,4 | 6,1 |

Megjegyzés:

Az S-tartományokat úgy számítottuk ki, hogy az idegen zsírt csak az egyedi összetételek meghaladásakor feltételezték (lásd a 4. táblázatot).

9. Idegen zsírok mennyiségi meghatározása

Ahhoz, hogy egy tejzsírminta idegenzsír-koncentrációjára vonatkozó mennyiségi információt nyerjünk, a következő képletet használjuk fel:

= 100 ·

100 - S

ahol X az ismeretlen idegen zsírnak vagy idegen zsírok keverékének a mennyisége egy ismeretlen tejzsírban. Az S egy ismeretlen idegen zsír hozzáadásának eredménye, amely abból származik, hogy a fenti teljes trigliceridképletbe behelyettesítjük az ismeretlen idegenzsír-/tejzsírkeverék trigliceridjeit is. Ha a tejzsírhoz ismeretlen idegen zsírt adnak hozzá, a különböző idegen zsírok átlagos S-értékét választjuk a teljes képletben SF-re; ezt az átlagos S-értéket úgy kapjuk meg, hogy a tiszta zsírokra vonatkozó triglicerid adatokat behelyettesítjük ebbe a képletbe, és kiszámítjuk az átlagértéket (SF = 7,46). Jó mennyiségi eredményeket kaphatunk bármely idegen zsír hozzáadásának mértékére úgy is, ha a pálmaolaj-/marhafaggyú-képletet alkalmazzuk (2. táblázat), és SF-értéknek 10,57-et veszünk.

Ismert idegenzsír-típusokra a következő SF-értékeket kell a fenti képletbe behelyettesíteni, és a 2. táblázatból a megfelelő idegenzsír-képletet kell hozzájuk választani:

5. táblázat

SF-értékek a különféle idegen zsíroknál

Idegen zsír | SF |

Szójababolaj | 8,18 |

Napraforgóolaj | 9,43 |

Olívaolaj | 12,75 |

Kókuszdiózsír | 118,13 |

Pálmaolaj | 7,55 |

Pálmamagolaj | 112,32 |

Repceolaj | 3,30 |

Lenmagolaj | 4,44 |

Búzacsíraolaj | 27,45 |

Kukoricacsíra-olaj | 9,29 |

Gyapotmagolaj | 41,18 |

Sertészsír | 177,55 |

Marhafaggyú | 17,56 |

Halolaj | 64,12 |

10. A kimutatási módszer alkalmazási tartománya

Az itt meghatározott módszer nagy tételben lévő tejekre érvényes, és a tejzsírminták reprezentatív jellegén alapul.

Igen specifikus kimutatásra lenne lehetőség, ha reprezentatív számú tejzsírra a fentiekhez hasonló összetételeket határoznának meg a különböző országokban.

Különösen alkalmas kimutatási lehetőségek adódnának, ha a különböző országokban használt összetételeket - ahogy azokat itt leírták - reprezentatív számú tejzsírra állítanák fel. Ebben az esetben nem szükséges komplex számítógépes programok használata, ha a 2. táblázatban használt trigliceridkombinációkat alkalmazzák, és a faktorokat a legkisebb négyzetek módszerével ismételten meghatározzák.

Az S-tartományoknak a 3. táblázatban bemutatott módon történő alkalmazásával a képletek érvényesek különleges takarmányozási körülmények között is, például elégtelen takarmányozás vagy a tehenek élelmiszer-élesztővel történő takarmányozása, esetleg kalcium-szappanok használata mellett. A képletek csak egészen szélsőséges takarmányozási körülmények (például tiszta takarmányolaj nagy mennyiségben való felvétele, kalcium-szappanok nagymértékben való adagolása takarmányzsírral kombinálva, stb.) esetén jelzik részlegesen a módosult tejzsírt.

Megjegyzés:

A frakcionált tejzsírokat általában módosítás nélküli tejzsírnak tekintjük, ha a módosítást csak a határértékek túllépése esetén feltételezzük. A képletekből csak akkor derül ki a módosítás, ha a frakcionált tejzsírban szokatlan tejzsírösszetevők vannak, például kemény frakció esetében, amit fizikai módszerekkel, megközelítőleg 30 oC-os, magas hőmérséklet mellett végzett, néhány százalékos, igen alacsony hozamú frakcionálással, vagy a kritikus érték feletti széndioxiddal végzett frakcionálással nyernek.

A tejzsír frakcionálása azonban kimutatható egyéb módszerekkel, például differenciál-scanning-kalorimetriával.

11. A módszer pontossága

Meghatározása tejzsír felhasználásával történt a 2. táblázatban található képletek és a 3. táblázat S-tartományai alapján.

11.1. Ismételhetőség

A lehető legrövidebb időeltéréssel egymás után, ugyanazon laboratóriumi személy által, azonos eljárással, azonos vizsgálati anyagon, ugyanolyan feltételek között (ugyanaz a személy, ugyanazok a eszközök/ugyanazok a műszerek, ugyanaz a laboratórium) elvégzett két meghatározás S- értékének különbsége:

6. táblázat

Ismételhetőségi határértékek (r) a különböző képletekre

A következő anyagok kimutatására alkalmazott képlet: | r |

Szójabab-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukorica- csíra-, gyapotmag-, halolaj | 0,67 |

Kókuszdió- és pálmamagzsír | 0,12 |

Pálmaolaj és marhafaggyú | 1,20 |

Sertészsír | 0,58 |

Teljes képlet | 1,49 |

11.2. Reprodukálhatóság

Különböző laboratóriumokban lévő személyzet által azonos vizsgálati eljárással, azonos vizsgálati anyagon, eltérő feltételek mellett (különböző személyek, különböző eszközök) különböző időpontokban elvégzett két meghatározás S-értékének különbsége.

7. táblázat

Reprodukálhatósági határértékek (R) a különböző képletekre

A következő anyagok kimutatására alkalmazott képlet: | R |

Szójabab-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukorica- csíra-, gyapotmag-, halolaj | 1,08 |

Kókuszdió- és pálmamagzsír | 0,40 |

Pálmaolaj és marhafaggyú | 1,81 |

Sertészsír | 0,60 |

Teljes képlet | 2,07 |

11.3. Kritikus eltérés

Az ismételhetőségi (r) és reprodukálhatósági (R) határértékek ismeretében a 3. táblázat összes S-tartományára kiszámíthatók a kritikus eltérések (kettős elemzések). A megfelelő értékeket a 8. táblázat tartalmazza.

8. táblázat

Kritikus eltérések valamennyi trigliceridképletre

A következő anyagok kimutatására alkalmazott képlet: | tartomány |

Szójabab-, napraforgó-, olíva-, repce-, lenmag-, búzacsíra-, kukorica- csíra-, gyapotmag-, halolaj | 97,43-102,57 |

Kókuszdió- és pálmamagzsír | 99,14-100,86 |

Pálmaolaj és marhafaggyú | 94,91-105,09 |

Sertészsír | 97,65-102,35 |

Teljes képlet | 94,58-105,42 |

11.4. Az eredmények elfogadhatósága

A két tizedesjegyre kerekítéssel számított, kalibrált C24, C26, C28-C54 trigliceridtartalmat, valamint a koleszterint pontosan 100-ra kell normalizálni.

A kettős elemzés eredményeit az ismételhetőségi feltétel ellenőrzésére lehet használni. Amennyiben az öt trigliceridképlet egyikében sem lépi túl két S-eredmény abszolút különbsége a 6. táblázatban szereplő r ismételhetőségi határt, akkor az ismételhetőségre vonatkozó követelmény teljesül.

Az optimális gázkromatográfiás feltételek, és különösen az oszlop minőségének szabályozása érdekében szavatolni kell, hogy 10 ismételt futtatásnál a maximális és minimális S-értékek különbsége az öt trigliceridképlet egyikénél se lépje túl az x · r tartományt, ha x = 1,58 (10 futtatás alatt, lásd a 16. számú hivatkozást), és a különböző képleteknek a 6. táblázat szerinti r ismételhetőségi határértékeit.

12. Idézett szabványok

DIN 10 336: 1994 | Nachweis and Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse |

1 C: 1987 IDF-szabvány | Tej. Zsírtartalom meghatározás - Röse-Gottlieb-féle gravimetrikus módszer |

16C: 1987 IDF-szabvány | Tejszín. Zsírtartalom meghatározás - Röse-Gottlieb-féle gravimetrikus módszer |

116A: 1987 IDF-szabvány | Tej alapú fagylaltok és fagylaltkeverékek. Zsírtartalom meghatározás - Röse-Gottlieb-féle gravimetrikus módszer |

22B: 1987 IDF-szabvány | Fölözött tej, savó és író. Zsírtartalom meghatározás - Röse-Gottlieb-féle gravimetrikus módszer. |

13. Hivatkozások

1. Commission of the European Communities: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis, Doc. No VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Commission of the European Communities: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. No VI/4577/93.

3. Commission of the European Communities: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Doc. No VI/2644/91, VI/91.11.8, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.

4. Timms, R.E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Trigylceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42143-157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch Forschungsber. 42119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42139-154 (1900).

10. Precht,D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93538-544 (1991).

12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p.123-138, Ed. K. D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, P. 378 (1970).

[1] Megfelelő módszerek tekintetében lásd D. Precht és J. Molkentin: Kvantitatív trigliceridanalízis rövid kapilláris kolonnák felhasználásával, Chrompack News 4, 16-17 (1993)

[2] A megfelelő termékek kereskedelmi forgalomban kaphatók

[3] Az olyan márkaneveket, mint pl. Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack csak példák a megfelelő és erre szakosodott kereskedelemben kapható termékekre. Ez a tájékoztatás csupán a szabványnak a felhasználó általi könnyebb kezelését szolgálja és semmiképpen nem jelenti egy adott termék ajánlását. A szemcseméret SI egységre (m) való átszámítása a BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves" szerint történt.

[4] Lásd a 192. oldal 3. lábjegyzetét.

--------------------------------------------------

XXVI. MELLÉKLET

AZ ELSŐ PREAMBULUMBEKEZDÉSBEN EMLÍTETT RENDELETEK FELSOROLÁSA

- Az összetett nómenklatúra bevezetését követően a tej- és tejtermékágazatra vonatkozó egyes intézkedéseknek a módosításáról szóló, 1987. december 22-i 222/88/EGK rendelettel [1] módosított, a harmadik országokból behozott összetett takarmányok laktóztartalmának meghatározására vonatkozó módszer megállapításáról szóló, 1968. augusztus 9-i 1216/68/EGK bizottsági rendelet [2],

- a legutóbb a bizonyos jelölőanyagoknak a vajban, a vajolajban és a tejszínben történő meghatározására szolgáló módszerek megállapításáról szóló 3942/92/EGK, 86/94/EK, 1082/96/EK és 1459/98/EK rendelet módosításáról szóló 175/1999/EK bizottsági rendelettel [3] módosított, a vajolajban a szitoszterin és sztigmaszterin meghatározására használt referenciamódszer megállapításáról szóló, 1992. december 22-i 3942/92/EGK bizottsági rendelet [4],

- a legutóbb a 175/1999/EK rendelettel módosított, a vajban a szitoszterin és a sztigmaszterin meghatározására használt referenciamódszer megállapításáról szóló, 1994. január 19-i 86/94/EK bizottsági rendelet [5],

- a közös piacszervezés szerint a tej és tejtermékek elemzése és minőségértékelése során alkalmazandó referencia- és rutinmódszerek alkalmazására vonatkozó szabályok megállapításáról szóló, 1995. november 24-i 2721/95/EK bizottsági rendelet [6],

- a vajban, a sovány tejporban és a kazeinben, illetve kazeinátokban a kólibaktériumok kimutatására szolgáló referenciamódszer megállapításáról szóló, 1996. június 14-i 1080/96/EK bizottsági rendelet [7],

- a juhtejből, kecsketejből vagy bivalytejből, illetve juh-, kecske- és bivalytej keverékéből készült sajtokban a tehéntej és kazeinát kimutatására szolgáló referenciamódszer megállapításáról, valamint a 690/92/EGK rendelet hatályon kívül helyezéséről szóló, 1996. június 14-i 1081/96/EK bizottsági rendelet [8],

- a legutóbb a 175/1999/EK rendelettel módosított, a vajsűrítményben és a vajban a béta-apo-8 karotinoid sav etil-észterének meghatározására szolgáló referenciamódszer megállapításáról szóló, 1996. június 14-i 1082/96/EK bizottsági rendelet [9],

- a legutóbb a 881/1999/EK rendelettel [10] módosított, a közös piacszervezés szerint a tej és a tejtermékek elemzése és minőségértékelése során alkalmazandó referenciamódszerek jegyzékének létrehozásáról szóló, 1996. szeptember 26-i 1854/96/EK bizottsági rendelet [11],

- a vaj víz-, zsírmentes szárazanyag- és zsírtartalmának meghatározására szolgáló referenciamódszerek megállapításáról szóló, 1998. április 24-i 880/98/EK bizottsági rendelet [12],

- a legutóbb a 175/1999/EK rendelettel módosított, a vajkoncentrátum, a vaj, illetve a tejszín vanillintartalmának meghatározásásra szolgáló referenciamódszer megállapításáról szóló, 1998. július 8-i 1459/98/EK bizottsági rendelet [13].

[1] HL L 28., 1988.2.1., 1. o.

[2] HL L 198., 1968.8.10., 13. o.

[3] HL L 20., 1999.1.27., 22. o.

[4] HL L 399., 1992.12.31., 29. o.

[5] HL L 17., 1994.1.20., 7. o.

[6] HL L 283., 1995.11.25., 7. o.

[7] HL L 142., 1996.6.15., 13. o.

[8] HL L 142., 1996.6.15., 15. o.

[9] HL L 142., 1996.6.15., 26. o.

[10] HL L 111., 1999.4.29., 24. o.

[11] HL L 246., 1996.9.27., 5. o.

[12] HL L 124., 1998.4.25., 16. o.

[13] HL L 193., 1998.7.9. 16. o.

--------------------------------------------------

Lábjegyzetek:

[1] A dokumentum eredetije megtekinthető CELEX: 32001R0213 - https://eur-lex.europa.eu/legal-content/HU/ALL/?uri=CELEX:32001R0213&locale=hu

32001R0213[1]

A Bizottság 213/2001/EK rendelete (2001. január 9.) a tej és tejtermékek elemzése és minőségértékelése tekintetében az 1255/99/EK tanácsi rendelet alkalmazása részletes szabályainak megállapításáról, valamint a 2771/1999/EK és a 2799/1999/EK rendelet módosításáról

I. MELLÉKLET

II. MELLÉKLET

III. MELLÉKLET

IV. MELLÉKLET

V. MELLÉKLET

VI. MELLÉKLET

VII. MELLÉKLET

IX. MELLÉKLET

X. MELLÉKLET

XI. MELLÉKLET

XII. MELLÉKLET

XIV. MELLÉKLET

XV. MELLÉKLET

XVI. MELLÉKLET

XIX. MELLÉKLET

XX. MELLÉKLET

XXI. MELLÉKLET

XXV. MELLÉKLET

Tartalomjegyzék